青钱柳愈伤组织总黄酮碱溶酸沉提取工艺

陈继光，米丽雪，上官新晨*，李 翔，钟世根

(江西农业大学食品科学与工程学院 天然产物研究与开发重点实验室，江西 南昌 330045)

青钱柳愈伤组织总黄酮碱溶酸沉提取工艺

陈继光，米丽雪，上官新晨*，李 翔，钟世根

(江西农业大学食品科学与工程学院 天然产物研究与开发重点实验室，江西 南昌 330045)

目的：研究以碱溶酸沉法提取青钱柳愈伤组织中的总黄酮。方法：采用碱溶酸沉法，对影响青钱柳愈伤组织中总黄酮提取的pH值、固液比、提取时间、硼砂用量等因素进行系统研究。结果：青钱柳愈伤组织中总黄酮碱提酸沉的最佳提取工艺为：采用固液比1∶20，碱提液pH9，硼砂含量2.5%，提取时间60min，酸沉pH 4.5。结论：在最佳提取工艺下，青钱柳愈伤组织中总黄酮得率达到4.01%。

青钱柳；愈伤组织；总黄酮；碱溶酸沉

青钱柳系双子叶植物纲胡桃科青钱柳属乔木植物，为我国特有[1]。研究表明[2-6]青钱柳含有丰富的天然药用成分，如多糖、黄酮、酚类、植物蛋白、皂苷、香豆精、生物碱、甾体、萜类、苷类、有机酸、胡萝卜素、VE、咖啡因等及一些人体必需的微量元素。《中国中药资源志要》记载，其树皮、叶具有清热消肿、止痛的功能，可用于治疗顽癣，长期以来民间用其叶片做茶[7]。李磊等[8-12]研究表明青钱柳嫩叶茶具有生津止渴、清热解暑、降压降脂血糖、增强机体免疫力及抗氧化防衰老的作用，可有效地用于防治糖尿病、高血压、冠心病及神经衰弱等疾病。

黄酮类化合物分子中含有多个酚羟基，一般显弱酸性，在碱性溶液中，黄酮类化合物易开环生成查耳酮型结构而多呈黄色、橙色或褐色，其机制是黄酮类化合物在碱性条件下苯并吡喃酮的1、2碳之间的C—O键开环成查耳酮型结构所致；在酸性条件下，查耳酮又恢复为闭环结构，黄色消失[13]。黄酮化合物经典的提取方法为有机溶剂提取法，尤其是醇提法。如董彩军[14]采用乙醇-水作为提取剂提取青钱柳叶中黄酮类化合物，其总黄酮得率为22.04mg/g。碱溶酸沉法相对醇提取法提取率稍低，但碱溶酸沉法具有工艺、设备简单，操作方便，产品安全，无环境污染，不使用有机溶剂，生产成本低等优点。刘金香等[15]利用碱溶酸沉法提取银杏叶总黄酮，使银杏叶总黄酮的提取率达到86.4%。目前，青钱柳愈伤组织中总黄酮的提取未见文献报道，笔者在超声条件下采用碱提酸沉法对青钱柳愈伤组织总黄酮进行提取并测定总黄酮得率，并确定了提取工艺的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

将青钱柳叶子接于附加0.5mg/L NAA和1.0mg/L 6-BA的MS培养基，于温度25℃，光强2000lx，黑暗培养7～10d后，再进行光暗交替12h/12h的条件下培养诱导青钱柳愈伤组织。

形成的愈伤组织继代培养于含30mL固体培养基的100mL的培养瓶中，MS＋0.3mg/L 2,4-D＋0.5mg/L KT＋3%蔗糖的培养基上，2周继代1次。在昼夜温度25℃，光强2000lx，光暗交替12h/12h的条件下培养。

氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、正丁醇、乙酸乙脂、9 5%乙醇、四硼酸钠、盐酸、氧化钙等均为市售分析纯；芦丁 中国药品生物制品检定所。

1.2 仪器与设备

KQ3200DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；QT-1旋涡混合器 上海琪特分析仪器有限公司；754型PC紫外可见分光光度计、光谱723型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

将收获的愈伤组织，去除底部琼脂，60℃烘干至恒质量，研磨后过100目筛网，装入密封袋放入干燥器中备用。

1.3.2 标准溶液制备

精密称取1 2 0℃干燥至质量恒定的芦丁标准品10mg，加80%乙醇溶解，定容，摇匀，即得质量浓度为0.2mg/mL芦丁标准液。

1.3.3 最大吸收峰的确定

精密量取芦丁标准液和样品液各2mL，加入质量分数5% NaNO2溶液0.3mL后，静置6min，加质量分数10% Al(NO3)3溶液0.3mL，静置6min后，再加入浓度1mol/L NaOH溶液4mL，分别用60%乙醇定容至10mL，摇匀，放置15min，用紫外可见分光光度计在400～700nm进行全波长扫描，最大吸收峰在503nm处。

1.3.4 标准曲线的绘制

图1 芦丁的标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

精密吸取标品质量浓度0.2mg/mL标准品溶液0、0.5、1.5、2、2.5、3、3.5、4mL，分别置于10mL试管中，加5% NaNO20.3mL，放置6min后，加10% Al(NO3)30.3mL，放置6min，再加4%氢氧化钠4mL，加水定容到10mL并摇匀，放置15min。根据最大吸收波长做标准曲线，不同质量浓度下的吸光度经最小二乘法作线性回归，得回归方程C＝0.1009A＋0.0005，R2＝0.996。

1.3.5 青钱柳愈伤组织总黄酮提取

精密称取500mg粉末于具塞试管中，加入3.5%硼砂，加入10mL pH9.0的饱和石灰水在60℃超声提取1h，抽滤后将滤液pH值调至4.5，将调好酸后的提取液加入10mL乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2次。将乙酸乙酯萃取液与正丁醇萃取液合并，旋转蒸干，加入一定量95%乙醇，超声溶解，并定容于10mL容量瓶中，待测液制好备用。

1.3.6 青钱柳组织细胞培养物中总黄酮得率测定

用NaNO2-Al(NO3)3比色体系检测青钱柳愈伤组织中总黄酮的得率。取0.1mL上述方法制备好的待测液于10mL具塞试管中按照标准品的显色方法处理，测定其吸光度，并代入回归方程计算样品中的总黄酮得率。实验均重复3次，结果取平均值。

式中：M为青钱柳组织细胞培养物干粉的质量/mg；A为吸光度；V为提取后定容的体积/mL；

1.3.7 数据处理

数据统计分析采用DPS数据处理系统，V6.55专业版。

2 结果与分析

2.1 固液比对青钱柳组织培养物中总黄酮得率的影响

在60℃、硼砂用量3.5%、石灰水pH9.0、超声提取时间60min、酸沉pH4.5的条件下，选取固液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，考察固液比对青钱柳愈伤组织总黄酮得率的影响，不同固液比的提取结果见图2。

图2 固液比对青钱柳组织培养物中总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

由图2可知，当固液比小于1∶20时，得率较低，而随着固液比的增大，青钱柳愈伤组织中总黄酮得率增大，且在1∶20时到达最大为4.06%；固液比大于1∶20时，总黄酮得率趋于平缓下降。这可能是由于固液比增大可以增加物料与溶剂的接触面积，使得黄酮类物质在更充分的溶解出来的同时也被部分水解[16]，所以确定最佳固液比为1∶20。

2.2 不同碱性提取液pH值对青钱柳组织培养物中总黄酮得率的影响

由于青钱柳黄酮类化合物含有酚羟基，具有弱酸性。因此提高提取溶剂的碱性对提取有利。用稀盐酸溶液调氢氧化钙溶液pH值分别为8.0、9.0、10.0、11.0、12.0进行实验，结果如图3所示。

图3 碱性提取液pH值对青钱柳组织培养物中总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extraction pH value on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

由图3可知，随着pH值增大，试样中黄酮得率增加，而后又减小，在pH10.0时，黄酮得率达到最大为4.03%。因青钱柳叶片所含黄酮类物质主要是山萘酚、槲皮素、异鼠李素等苷类化合物[17]，其结构均含有多个酚羟基，呈一定酸性，与稀Ca(OH)2溶液反应，可生成易溶于水的盐类，因此，碱用量增加，pH值增大，黄酮类物质溶解量增多，提取液中黄酮得率相应提高。但如碱液浓度过高或溶液pH值过大，黄酮母核遭到破坏，而致黄酮得率下降。

2.3 硼砂用量对青钱柳组织培养物中总黄酮得率的影响

图4 硼砂用量对青钱柳组织培养物中总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of borax amount on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

青钱柳总黄酮分子中含有邻二酚羟基，在空气中易被光分解而变为暗褐色，在碱性条件下更易被氧化分解，硼酸盐能与邻二酚羟基结合而达到保护的目的，因此在用碱液加热提取黄酮时，往往加入少量硼砂作为保护试剂以减少其所含黄酮类化合物氧化分解。

由图4可知，总黄酮得率随硼砂用量的增加呈先增加后减小的趋势，当硼砂质量分数为2.5%时，总黄酮得率达到最大值为3.65%。因此，选择硼砂含量为2.5%可达较好的提取效果。

2.4 提取时间对青钱柳组织培养物中总黄酮得率的影响

图5 提取时间对青钱柳组织培养物中总黄酮得率的影响Fig. 5 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

从图5可以看出，随着提取时间的增加总黄酮得率也增加，但时间达到60min时，黄酮得率最高为3.78%。随着时间的增加，得率反而下降，这可能是因为随着提取时间的增加，黄酮类物质发生氧化、分解而导致得率下降。另外，媒质里的其他杂质也大量溶出使总黄酮百分含量下降，同时也增加能耗。

2.5 酸沉pH值对青钱柳组织培养物中总黄酮提取得率的影响

图6 酸沉pH值对青钱组织培养物中总黄酮得率的影响Fig. 6 Effect of acid precipitation pH value on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

为了尽可能回收黄酮类化合物，用稀HCl溶液将碱性石灰水提取液调节pH值分别为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5。由图6可看出，在酸性范围内，随酸度减小，样品中黄酮类化合物含量随之增加，而后酸度再减小其含量也随之减小，在pH4.5时，达到最高为3.93%。由于黄酮类化合物可溶于碱性溶液，加酸时又沉淀析出，故随酸度增大，黄酮类物质析出量相应增多。但因黄酮母核中吡喃环上的氧原子有一定碱性，在酸性较强时，易形成盐而溶解，导致部分黄酮损失。

2.6 碱提酸沉法提取青钱柳组织培养物中总黄酮的正交试验设计

表1 L9(34)青钱柳愈伤组织提取正交试验设计及结果Table 1 Orthogonal array design and results for optimal extraction of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

表2 黄酮得率正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis for extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus with various process conditions

表3 Duncan新复极差法多重比较Table 3 Duncan multiple comparison of total flavonoids extraction rate

参考单因素试验结果，以石灰水溶液为提取剂，选取碱性提取液pH值、硼砂用量及提取时间、酸沉pH值4个因素为考察因素，以青钱柳愈伤组织中总黄酮得率为指标，确定各正交设计因素的水平，按L9(34)正交表对碱法提取工艺进行研究，确定青钱柳愈伤组织总黄酮碱法提取的最佳工艺参数。正交试验设计与结果见表1，利用DPS软件通过极差分析、方差分析和Duncan新复极差法多重比较，优选出碱提酸沉法提取青钱柳组织中总黄酮的最佳工艺参数。正交试验设计的各因素水平及结果见表1。

从表1数据分析结果可知，影响青钱柳愈伤组织中总黄酮得率各因素主次关系为：D＞B＞C＞A。其中硼砂含量、酸沉pH值和提取时间对青钱柳愈伤组织中总黄酮得率影响极显著，碱液pH值对青钱柳愈伤组织中总黄酮提取影响不显著。因此，综合极差和Duncan分析结果，得到青钱柳愈伤组织中总黄酮提取最优工艺参数为A1B2C2D2，即碱液pH9、硼砂含量2.5%、提取时间60min、酸沉pH4.5。

2.7 提取次数和重现性实验

在正交优化条件下分别做提取次数实验和重现性实验，确定提取级数对青钱柳组织培养物中总黄酮得率的影响和优化条件的可行性和重现性。

表4 提取次数实验结果Table 4 Effect of repeated extraction number on extraction rate of total flavonoids

表5 重复性实验结果Table 5 Results of reproducibility experiments

表4浸提次数结果表明，第1次浸提的青钱柳愈伤组织中总黄酮提取率之和占3次浸提提取率总和的97.4%，从节约浸提成本的角度考虑，采用一级浸提。表5结果表明，正交优化条件下提取试验的重现性较好(RSD＝2.26%)，黄酮得率达4.01%。

3 结 论

本实验应用超声辅助技术，采用碱液提取法提取青钱柳组织细胞培养物中的总黄酮，通过单因素和正交试验，确定了碱提酸沉法提取青钱柳愈伤组织总黄酮的最佳提取条件为：固液比1∶20、碱液pH9、硼砂含量2.5%、提取时间60min、酸沉pH4.5，在此条件下青钱柳愈伤组织中总黄酮得率为4.01%。采用此法，总黄酮得率较高，且使用水为提取溶剂，具有成本低、污染性小等特点．具有较高的实用价值。

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Optimization of Alkali Extraction and Acid Precipitation Process for Total Flavonoids from Cyclocarya paliurus Callus

CHEN Ji-guang，MI Li-xue，SHANGGUAN Xin-chen*，LI Xiang，ZHONG Shi-gen
(Key Laboratory of Natural Products Research and Development, College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China)

Objective∶ To optimize the alkali extraction and acid precipitation of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus. Methods∶ The effects of pH, material/liquid ratio, borax amount and extraction time on the extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus. Results∶ The optimal extraction conditions were extraction solvent pH of 9.0, borax amount of 2.5%, extraction time of 60 min, and acid precipitation pH of 4.5. Conclusion∶ Under the optimal conditions, the extraction rate of total flavonoids was up to 4.01%.

Cyclocarya paliurus；callus；total flavonoids；alkali extraction and acid precipitation

S336；O623.59

A

1002-6630(2011)16-0103-05

2010-10-29

江西省主要学科学术和技术带头人项目(2009DD00900)；江西省科技厅支撑项目(2009BSB09100)

陈继光(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为植物资源利用开发。E-mail：chenjiguang1@126.com

*通信作者：上官新晨(1962—)，男，教授，博士，研究方向为天然产物研究与开发。E-mail：shangguanxc_818@sina.com