苹果果皮中类黄酮的超声波辅助提取及稳定性研究

王 英，张玉刚，戴洪义*

(青岛农业大学园林园艺学院，山东 青岛 266109)

苹果果皮中类黄酮的超声波辅助提取及稳定性研究

王 英，张玉刚，戴洪义*

(青岛农业大学园林园艺学院，山东 青岛 266109)

应用超声波法提取苹果果皮中的类黄酮，得到类黄酮提取的最佳工艺条件，并对产品稳定性进行研究。结果表明：苹果果皮中类黄酮的最佳提取条件为温度60℃、乙醇体积分数60%、提取时间20min、料液比1∶25 (g/mL)，此条件下提取率为27.56mg/g，超声波法提取苹果果皮中类黄酮重现性好，相对标准偏差0.55%；提取的类黄酮在pH6.0左右较稳定，温度超过40℃时稳定性较差，光照会使类黄酮稳定性降低；H2O2、Na2SO3和NaNO2使类黄酮吸光度明显下降，VC对类黄酮吸光度下降不明显。Mg2＋、Ca2＋使类黄酮提取液吸光度增大，Pb2＋、Cu2＋、Fe3＋使其吸光度降低，Zn2＋、Al3＋、K＋对其吸光度影响不大。苹果果皮类黄酮不耐高温、不耐酸碱，VC、Zn2＋、Al3＋、K＋对其稳定性的影响不明显，H2O2、Na2SO3、NaNO2、Mg2＋、Ca2＋、Pb2＋、Cu2＋、Fe3＋对其稳定性影响明显。

苹果果皮；类黄酮；超声波提取；稳定性

类黄酮是广泛存在水果和蔬菜中的一类次生代谢物质，具有很强的清除自由基[1]、抗衰老、增加机体免疫力的作用[2-3]，因此，类黄酮已经成为近年来研究的热点[4]。苹果果实中含有丰富的类黄酮物质，而果皮中类黄酮种类及含量远远大于果肉部分[5-6]，Tsao等[7]对8个苹果品种进行了测定，果皮中含834.2～2300.3mg/kg，果肉中含15～605.6mg/kg。随着人们对食品安全认识的提高，往往由于惧怕果皮中农药残留而将其弃去，造成了营养物质的极大浪费，充分利用果皮不但可以提高苹果资源的利用率，还可以为苹果加工产业提供新的出路。

超声波辅助提取是一种利用外力强化提取的新技术[8]，有助于溶质扩散，可以明显地加速植物体和种子中有机成分的提取过程，在天然产物提取中显出明显优势[9-10]。本实验拟采用超声波法提取苹果果皮中的类黄酮，以乙醇为提取剂，确定类黄酮提取的最佳工艺，并分析光照、温度、p H值、氧化剂、还原剂及金属离子对苹果类黄酮提取液稳定性的影响，以期为对苹果果皮综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

青岛农业大学培育的苹果杂种品系95-32(特拉蒙×嘎啦)的果实。

乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、H2O2、KCl、AlCl3、CaCl2、FeCl3、Pb(CH3COO)2、HCl、NaOH (上述试剂均为分析纯)；芦丁标准品(纯度＞95%) 上海同田生化技术有限公司。

FD-1-50型冷冻干燥机 上海比朗仪器有限公司；HR2006型搅拌机 荷兰飞利浦公司；KQ-300型数控超声波清洗器(超声功率210W，40Hz) 昆山市超声仪器有限公司；SBH-ⅢS循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；Ultrospec 3300 pro型紫外-可见光分光光度计 美国安玛西亚公司。

1.2 方法

1.2.1 类黄酮含量测定

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系络合化学吸光法[11]测定类黄酮含量，在500nm波长处测吸光度。

1.2.2 苹果果皮中类黄酮的超声波辅助提取方法及提取率计算

称取适量的冻干粉碎的苹果果皮于具塞三角瓶中，按一定的料液比和质量浓度加入溶剂，在一定温度下超声提取一定时间，过滤，定容，按1.2.1节方法测定其吸光度。

式中：提取率以1g苹果果皮粉提取总黄酮的毫克数表示，单位为mg/g；C为质量浓度/(mg/mL)；V为滤液定容体积/mL；m为所用苹果果皮粉的质量/g。

1.2.3 正交试验设计

选择乙醇溶液作为苹果果皮的有机溶剂提取液。通过单因素试验测定，采用L9(34)正交试验组合表，对提取温度(50、60、70℃)、乙醇体积分数(50%、60%、70%)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25)和提取时间(20、30、40min)各因素进行正交试验，研究各因素对苹果果皮类黄酮提取率的影响。

1.2.4 类黄酮的稳定性测定

采用1.2.1节方法测定不同pH值、温度、光照、N a C l、蔗糖、金属离子、氧化剂、还原剂条件下苹果类黄酮吸光度变化，观察测定各因素对类黄酮化合物的稳定性影响。

2 结果与分析

2.1 苹果果皮中类黄酮超声波辅助提取最佳条件的确定

表1 苹果果皮中类黄酮超声波辅助提取正交试验设计及结果Table 1 Orthogonal array design for optimizing ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from apple peel and corresponding experimental results

正交试验的极差分析结果(表1)表明：4因素对苹果黄酮提取量的影响程度从高到低依次为乙醇体积分数＞提取温度＞料液比＞超声提取时间，结合k值可以确定最佳提取工艺条件应为A2B2C1D3，即提取温度60℃、乙醇体积分数60%、料液比1∶25(g/mL)、超声提取时间20min。

按正交试验结果确定的最佳工艺，重复提取苹果果皮3次，经提取计算和含量测定结果表明该工艺重现性好，达到了优化的目的，结果为类黄酮平均提取率27.56mg/g，相对标准偏差0.55%。

2.2 不同因素对苹果果皮中类黄酮稳定性的影响

2.2.1 温度对苹果果皮类黄酮稳定性的影响

将提取液分别在20、40、60、80℃条件下保温，分别于1、2、7h后取出，冷却后观察溶液颜色的变化并测定吸光度。由图1可知，在40℃以下苹果皮中类黄酮类化合物比较稳定，40℃以上吸光度明显增大，且颜色逐渐加深。当超过60℃时随着时间的延长其吸光度变化较大，7h后其吸光度增大较快，说明在较高温度下类黄酮稳定性较差[12]。因此，由实验结果可知，苹果皮中黄酮类化合物耐热性较差，应在40℃以下使用。

图1 温度对类黄酮稳定性的影响Fig.1 Effect of temperature on the stability of apple peel flavonoids

2.2.2 酸、碱对苹果果皮中类黄酮的稳定性影响

用HCl、NaOH调节黄酮提取液的pH值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，室温放置12h在波长500nm处测定类黄酮提取液的吸光度。

图2 不同酸碱度对类黄酮稳定性的影响Fig.2 Effect of pH value on the stability of apple peel flavonoids

由图2可知，提取液pH6.0时吸光度最大，与原样液吸光度接近。颜色变化：pH值减小时黄色逐渐变浅；pH值增大时黄色逐渐加深且吸光度变小。说明苹果果皮中黄酮类化合物在酸碱性较强的环境中容易受到破坏，表现出不稳定性。

2.2.3 H2O2对苹果果皮中黄酮类化合物稳定性的影响

向提取液中加入H2O2，使其质量分数分别0.005%、0.01%、0.05%、0.1%，室温放置1h和6h后测定溶液吸光度。由图3可知，苹果果皮中黄酮类化合物的吸光度随H2O2浓度的增加而逐渐减小，6h后所测的吸光度下降的幅度比1h后所测值大，说明放置时间越长类黄酮化合物对氧化剂的稳定性越差。强氧化剂H2O2可以使类黄酮结构中的杂环开裂，起到氧化降解作用[13]。因此，在苹果果皮提取液储存和使用时应注意避免其与氧化剂接触。

图3 H2O2质量分数对类黄酮稳定性的影响Fig.3 Effect of H2O2on the stability of apple peel flavonoids

2.2.4 光对苹果果皮中黄酮类化合物稳定性的影响

将提取液于室温条件下分别放置于黑暗处、自然光与太阳光下，测定不同光照对苹果类黄酮稳定性的影响。由图4可知，在不同的光照条件下类黄酮的稳定性有一定的差异：在避光、自然光及太阳光下放置5d后，类黄酮提取液的吸光度分别下降7.8%、13.7%、22.3%；在自然光和太阳光下不稳定，这是由于类黄酮物质发生了自身氧化聚合，使其部分降解；随着时间延长，颜色由亮黄色变为土黄色；在阳光下长时间放置，类黄酮提取液中有沉淀出现；在避光保存下，提取液吸光度变化不大，所以苹果果皮类黄酮提取液应避光保存。

图4 光对类黄酮稳定性的影响Fig.4 Effect of light on the stability of apple peel flavonoids

2.2.5 金属离子对苹果皮中黄酮类化合物的稳定性的影响

向提取液中分别加入AlCl3、CuCl2、MgCl2、ZnCl2、KCl、CaCl2、Pb(C2H3O2)2，使其浓度梯度均为0.01、0.05、0.10、0.20mol/L以及FeCl3浓度梯度为0.0005、0.001、0.005、0.01mol/L，室温放置6h后测定测定苹果皮中类黄酮提取液的吸光度。由表2可知，各种金属离子对类黄酮吸光度均有一定影响，放置6h后，类黄酮提取液在浓度为0.01mol/L Mg2+、Ca2+影响下吸光度分别升高37.9%，41.9%，在浓度为0.01mol/L的Zn2+、Al3+、K+、Pb2+、Cu2+影响下吸光度分别降低6.0%、6.4%、3.8%、23.0%、37.4%，而浓度为0.01mol/L Fe3+吸光度降低55.2%，说明Mg2+、Ca2+、Pb2+、Cu2+、Fe3+对类黄酮稳定性影响较大。原因可能是由于黄酮类化合物的邻二酚羟基与金属离子络合而引起的[14-15]。因此，在类黄酮提取液储存过程中应避免与铁、铜、铝、铅、镁的容器接触。

表2 金属离子对类黄酮稳定性的影响Table 2 Effects of metal ions on the stability of apple peel flavonoids

表3 不同浓度的Fe3+对类黄酮稳定性的影响Table 3 Effect of different concentrations of Fe3+on the stability of apple peel flavonoids

2.2.6 NaNO2、VC、Na2SO3对苹果果皮类黄酮提取液的影响

图5 不同还原剂对苹果类黄酮的影响Fig.5 Effect of reducing agents on the stability of apple peel flavonoids

向提取液中分别添加2%的NaNO2、VC、Na2SO3，分别放置0、1、2、3、4d测定其吸光度。由图5可知，还原剂Na2SO3和NaNO2对类黄酮稳定性影响较大，常温放置4d后添加2%的Na2SO3、NaNO2、VC及原液的类黄酮提取液吸光度分别下降47.7%、34.0%、10.9%和1.6%。亚硫酸盐和亚硝酸盐较类黄酮类物质更易氧化。加入VC的提取液颜色变浅，吸光度降低，原因在于抗坏血酸引起了提取液中类黄酮的降解[16]。VC对类黄酮具有双重作用，当含量较少时有促进类黄酮稳定的作用，当VC含量高时会对类黄酮稳定性有负面效应[17]，所以在食品应用中应合理应用。

3 结 论

3.1 苹果果皮类黄酮超声波辅助提取的最佳条件为提取温度60℃、提取时间20min、乙醇体积分数60%、料液比1∶25(g/mL)，此条件下提取率可达27.56mg/g。各因素影响顺序为乙醇体积分数＞提取温度＞料液比＞提取时间。

3.2 苹果果皮类黄酮在pH6.0左右比较稳定，在强酸和强碱条件中稳定性较差。氧化剂H2O2和还原剂NaNO2、Na2SO3对类黄酮稳定性影响较大，VC对其稳定性影响较小。高温加热对黄酮稳定性有一定影响，应尽量在低温下贮存。类黄酮提取液对光稳定性较差，长时间贮存应避光保存。类黄酮对葡萄糖，N a C l较稳定。Al3+、Cu2+、Pb2+、Fe3+、Mg2+对其影响较大，Zn2+、K+、Ca2+对其影响较小。在生产和贮存使用过程中应避免与类黄酮稳定性有关的不利因素，以保持类黄酮化合物的稳定性。

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Ultrasonic-assisted Extraction and Stability of Flavonoids from Apple Peel

WANG Ying，ZHANG Yu-gang，DAI Hong-yi*
(College of Landscaping and Horticulture, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

In this study, orthogonal array design was employed to optimize the conditions for ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from apple peel. Along with this, the stability of flavonoids extracted from apple peel was evaluated. The optimal extraction conditions were extraction temperature of 60 ℃, ethanol concentration of 60%, extraction duration of 20 min, and material-to-liquid ratio of 1∶25. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of flavonoids was 27.56 mg/g. Meanwhile, the extracted flavonoids were stable at pH 6.0 and unstable at a temperature over 40 ℃. Light illumination could result in a decrease of stability. In addition, H2O2, Na2SO3, NaNO2, Pb2+, Cu2+, and Fe3+could obviously reduce the absorbance of flavonoids; on the other hand, Mg2+and Ca2+could result in an increase in the absorbance of apple peel flavonoids. Vitamin C, Zn2+, Al3+, and K+did not reveal obvious effect on the absorbance of apple peel flavonoids. Therefore, ultrasonic-assisted extraction reveals high efficiency and reproducibility with RSD of 0.55% in extracting apple peel flavonoids. Flavonoids from apple peel have weak tolerance to high temperature as well as strong acid and alkali. Although VC, Zn2+, Al3+, and K+exhibit less effect on the stability of apple peel flavonoids, H2O2, Na2SO3, NaNO2, Mg2+, Ca2+, Pb2+, Cu2+and Fe3+have obvious impact on the stability of apple peel flavonoids.

apple peel；flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；stability

TS202.1

A

1002-6630(2011)16-0178-04

2010-11-09

国家现代农业(苹果)产业技术体系项目(CARS-28-01-07)；山东良种产业化工程项目

王英(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为果树育种与生物技术。E-mail：ying841063@163.com

*通信作者：戴洪义(1956—)，男，教授，硕士，研究方向为果树育种。E-mail：hydai@qau.edu.cn