大孔吸附树脂吸附分离高活性玉米抗氧化肽

刁静静，曹龙奎,2,*

(1.黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319)

大孔吸附树脂吸附分离高活性玉米抗氧化肽

刁静静1，曹龙奎1,2,*

(1.黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319)

采用大孔吸附树脂对玉米抗氧化肽进行分离，通过单因素试验得出XAD-7HP树脂为最适树脂，在此基础上，研究不同pH值条件下的静态吸附能力和不同解吸剂的静态解吸能力等实验，确定玉米抗氧化肽吸附分离的基本参数为pH7.0、解吸剂体积分数70%。通过动态吸附分离实验得出，该树脂可以达到分离纯化玉米抗氧化肽的目的，而且分离后的玉米肽的抗氧化活性比原液提高了1倍。

大孔吸附树脂；玉米抗氧化肽；静态吸附；解吸

玉米肽具有降血压、抗氧化、抗疲劳、醒酒护肝等功效，所以对玉米肽的开发具有广泛的应用前景，而且随着科技的发展，人们健康意识的提高及保健意识的增强，玉米活性肽的药食同源性将更加显示出其广阔的应用前景。虽然目前对于玉米肽的各种生物活性研究的比较多，但是对于玉米活性肽的快速、简便、高效的分离方法还需要进一步的探索。

从研究报道中可以看出肽类的分离纯化方法主要应用大孔吸附树脂[1-4]、凝胶过滤色谱[5-6]、离子交换色谱[7-8]、高效液相色谱[9-11]、疏水相互作用色谱[12]、亲和色谱及薄层层析[13]等，其中凝胶过滤色谱、高效液相色谱、亲和色谱等分离手段虽然精确，但是其造价太高不适于工业化，大孔吸附树脂、离子交换层析等分离纯化方法还没有可以达到产业化得水准。目前对于肽类的工业化分离多采用具有分子筛功能的膜分离系统，但是分离膜抗污染能力差，膜通量衰减严重，而且分离过程中对操作参数的控制随意性太大。大孔吸附树脂是一种人工合成的多聚物吸附剂，而且吸附树脂比其他天然吸附剂具有不可替代的优点：孔径大小、比表面积和极性可以任意选择，而且有吸附快、解吸率高、吸附量大、再生简单等优点，所以在食品中的应用前景广阔，而且对玉米抗氧化肽的分离使用大孔吸附树脂的研究尚未见报道，本研究利用大孔吸附树脂对玉米抗氧化肽的静态吸附能力进行研究，从不同型号树脂的筛选、不同pH值条件下的吸附能力、不同解吸剂的解吸能力等综合考察吸附树脂对玉米抗氧化肽的吸附能力，为下一步动态吸附以及产业化连续分离提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

玉米蛋白粉 黑龙江昊天玉米开发有限公司；Alcalase(液态，酶比活力160000U/mL) 丹麦Novo公司；大豆卵磷脂、抗坏血酸钠、2,2-二苯基-1-间三硝基苯基联肼(DPPH) 美国Sigma公司；组氨酸、L-酪氨酸 北京索莱宝科技有限公司；氯仿、硫代巴比妥酸(均为分析纯) 隆宽医药有限公司；大孔吸附树脂 沧州宝恩吸附材料科技有限公司。

DK-S24型电热恒温水浴锅 上海森信试验仪器有限公司；LNK-871型凯式定氮仪 江苏省宜兴市科教仪器研究所；AR2104精密电子天平、DELTA 320型pH计梅特勒-托利多仪器有限公司；可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；单柱色谱分离系统 自行研制。

制备单柱色谱分离系统的分离原理：与液相色谱吸附分离的原理类似，利用某种吸附剂对基质吸附性能的差异，通过吸附-洗脱的过程，使性质很相近的几种物质达到分离。

图1 单柱色谱分离系统流程图Fig.1 Flow chart of a single column chromatographic separation system

1.2 方法

1.2.1 玉米蛋白粉的处理

将原料玉米蛋白粉经粉碎机粉碎后过筛，收集过筛后的淡黄色粉末，再以95%乙醇作为浸提剂去掉玉米黄色素，得到酶解底物。

表1 各种大孔树脂的化学及物理性质Table 1 Chemical and physical properties of three types of macroporous resins used in this study

1.2.2 酶水解试验

将去掉玉米黄色素的玉米蛋白粉(玉米蛋白含量68.32%)，与适量的水混合，配制成底物质量分数5%的样品溶液，用1mol/L NaO H溶液调节溶液pH9.0，加入1mL/g的碱性蛋白酶(按溶质含量计)，50℃水浴振荡水解，反应过程中不断加入1mol/L NaOH溶液，使pH值保持恒定，记录耗碱量(mL)，用于计算水解度(degree of hydrolysis，DH)。待水解结束后调节pH值到7.0，并在搅拌条件下迅速升温至95℃，保持10min使酶灭活[13]。预实验已经确定抗氧化能力较强的水解液的水解度及水解时间，将抗氧化能力较强的水解液冻干后备用。

1.2.3 静态吸附试验

1.2.3.1 大孔吸附树脂的处理

取适量大孔吸附树脂，用95%乙醇浸泡24h，充分溶胀后用蒸馏水洗净备用[2]。

1.2.3.2 不同树脂对玉米抗氧化肽的吸附能力及解吸能力

准确称取已处理好的各种类型的大孔吸附树脂10g放入2 5 0 m L三角瓶中，分别加入玉米蛋白水解液50mL，使树脂完全浸泡，放入25℃的恒温振荡器中振荡(180r/min)，吸附一定时间后，过滤，测定吸附前后水解液的体积及多肽含量，以计算吸附量。

将吸附玉米抗氧化肽后的不同型号树脂用70%乙醇溶液分别处理，方法同吸附能力试验方法，在同一温度及转速条件下进行解吸5h，测定解吸量，以此筛选出合适的树脂进行以下试验。

1.2.3.3 不同pH值玉米抗氧化肽的静态吸附试验

准确称取已确定的大孔吸附树脂10g放入250mL的三角瓶中，分别加入不同pH值(pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的玉米蛋白水解液50mL，使树脂完全浸泡，放入25℃的恒温振荡器中振荡(180r/min)，吸附一定时间后，过滤，测定吸附前后水解液的体积及多肽含量，以计算吸附量。

1.2.3.4 静态解吸试验

将处理好的树脂10g和50mL玉米蛋白水解液一起加入到250mL三角瓶中，置于恒温振荡器上振荡(180r/min)一定时间后，选择不同的洗脱溶剂对吸附玉米抗氧化肽后的树脂进行洗脱，洗脱剂分别选用无离子水和10%、30%、50%、70%、95%的乙醇溶液各20mL，在同条件下振荡，待解吸一定时间后，测定解吸液的体积及蛋白含量。

解吸量/(mg/mL)＝解吸液蛋白质量浓度×解吸液体积

1.2.4 大孔吸附树脂对玉米抗氧化肽的动态吸附和解吸试验

将处理过的XAD-7HP树脂装入1.0×100cm的层析柱中，在25℃条件下将pH7.0的玉米抗氧化肽溶液上柱，用40%的乙醇溶液作为洗脱剂，用紫外检测器于215nm波长处检测流出液的吸光度，收集洗脱峰，干燥备用。

1.2.5 抗氧化能力的测定

参照Saiga等[14]的方法，并略作修改。将动态解吸后的玉米肽配制成一定浓度，取0.5mL及1×104mol/L DPPH溶液3.5mL加入同一带塞试管中摇匀，室温密闭静置30min，用纯溶剂作参比，于517nm波长处测吸光度。根据下列公式计算每种水解液对DPPH自由基的清除率：

式中：A1为加水解液后DPPH溶液的吸光度；A2为水解液的吸光度；A3为未加水解液时DPPH溶液的吸光度。

1.2.6 数据分析

所得数据均为3次重复的平均值，用Statistix 8.0分析软件进行统计，平均数之间显著性差异(P＜0.05) 通过Turkey HSD进行多重比较分析。并用Sigmaplot 9.0和Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同树脂对玉米蛋白水解液的吸附能力

由图2可以看出，在同一条件下，不同型号树脂对玉米蛋白水解液的吸附能力，其中C型树脂的吸附能力明显大于A型和B型树脂(P＜0.05)。虽然这3种树脂都属于中极性树脂，但是由于其树脂的孔径、比表面积和形成氢键等因素的不同所得出的结果也不同，而且直接影响到吸附能力。A型和B型树脂的比表面积相同，而且平均孔径大小差异不显著，因此其吸附能力差异不显著(P＞0.05)，而C型树脂的平均孔径明显大于A型和B型，因此其吸附能力也明显大于A和B两种树脂。

图3反映的是A、B、C 3种树脂在同一温度下分别采用70%乙醇溶液作为解吸剂条件下的解吸能力，从解吸效率、易于蒸馏回收、节能、价廉和毒性角度来选择解吸剂，其中以醇类较佳，所以本实验采用乙醇作为解吸剂[15]。从图3可知，C型树脂的解吸能力明显强于其他两种树脂，差异显著(P＜0.05)，A型和B型树脂的解吸能力差异不显著。这可能是由于：虽然这, 3种树脂都是针对肽类进行吸附分离的，但是由于前两种树脂的结构与C型树脂的不同，孔径大小也不同，所以吸附原理不同，因此表现差异比较显著(P＜0.05)。通过图2、3得出，C型树脂的吸附能力和解吸能力都符合试验需求，选定C型树脂为最适树脂。

图2 不同型号树脂的吸附能力Fig.2 Effect of resin type on adsorption capacity

图3 不同型号树脂的解吸能力Fig.3 Effect of resin type on desorption capacity

2.2 不同pH值的玉米蛋白水解液的静态吸附试验

图4 不同pH值玉米蛋白水解液的吸附量Fig.4 Effect of pH value on adsorption capacity of XAD-7HP resin

从图4可以看出，不同pH值的玉米蛋白水解液在同一吸附条件下的吸附量，在同一pH值、25℃条件下采用180r/min进行恒温振荡，玉米蛋白水解液的吸附能力都是随吸附时间的延长而增加，而且在不同pH值条件下的吸附能力不同。从图4可以看出，pH3.0、6.0、7.0时，其吸附能力要明显优于其他pH值条件下的吸附能力(P＜0.05)，在pH值大于7.0时，玉米蛋白水解液的吸附能力较差，这是由于树脂具有吸附性与范德华力和氢键有关，又因具有网状结构和很高的比表面积而具有筛选性能[16]。C型树脂能将极性的有机化合物吸附，主要依靠分子中的偶极离子及氢键的作用。而且由于是分子吸附，因而解吸也比较容易。由于pH7.0时的吸附能力与pH6.0时的差异不显著，而且为了下一步在工业化生产中节省成本，最终得出pH7.0为最适pH值。

2.3 静态解吸试验

图5 不同体积分数解吸剂对解吸量的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption capacity of XAD-7HP resin

由图5可知，在用水作为解吸剂时，随着解吸时间的延长其解吸量增加，而用10%乙醇溶液进行不同时间解吸时，10、20min和30min之间的解吸量差异不显著(P＞0.05)，40min与10min相比差异显著(P＜0.05)。用30%乙醇溶液解吸时，10min的解吸量与其他3个时间的解吸量差异显著(P＜0.05)，而其他3个样品间的解吸量差异不显著(P＞0.05)。在解吸剂为50%或70%的乙醇时，30min的解吸量要高于等体积分数条件下的其他解吸时间的解吸量，而且差异显著(P＜0.05)，这是由于随着解吸时间的延长解吸量增加，所以30min的解吸量高于10min和20min的解吸量，而大于40min的解吸量时，可能是由于在较低浓度下，其解吸的速率要低于其吸附的速率，玉米蛋白水解液在此条件下又进行吸附，所以解吸量在40min时有所降低。在用95%乙醇进行解吸时，则随着解吸时间的延长解吸量增加，这是因为乙醇体积分数太高，一些蛋白和肽类物质难于溶解。所以确定70%的乙醇溶液为最佳的解吸剂。

2.4 动态吸附与解吸试验

2.4.1 玉米蛋白水解液的动态吸附与解吸试验

将30mL 5%的玉米蛋白水解液通过内径为1.0× 100cm的不锈钢色谱柱，装柱的XAD-7HP树脂为100g。用2倍于柱体积的70%乙醇溶液进行解吸，控制流速为4mL/min，分别以2min/管接收流出液(反复几次收集)，用紫外检测器检测其出峰时间，得到玉米蛋白水解液的解吸曲线，并将收集液冷冻干燥并进行活性测定。

图6 玉米抗氧化肽的解吸曲线Fig.6 Desorption curve of antioxidant maize peptides from XAD-7HP resin

由图6可知，10min左右玉米肽就可以被洗脱下来，70min左右被吸附的玉米肽基本解吸干净；而且在10min左右时，玉米肽在此洗脱流速下解吸曲线上升较快，而在25min后，解吸曲线下降缓慢，洗脱速率减慢，这主要是因为相对分子质量较大的组分在70%乙醇溶液中溶解度较低而不容易被解吸下来[17-18]。这说明C型树脂可以吸附玉米抗氧化肽，而且解吸也比较容易。

2.4.2 XAD-7HP树脂处理后对玉米抗氧化肽活性的影响

图7 XAD-7HP树脂处理对玉米抗氧化肽活性的影响Fig.7 DPPH free radical scavenging rates of maize protein hydrolysate and various elution fractions from XAD-7HP resin

将玉米抗氧化肽解吸时的收集液，每5管合并(即0～10min为1号样品，10～20min为2号样品，以此类推)，冷冻干燥后，将其配制成1%的溶液，进行抗氧化活性的测定。从图7可知，1号样品的抗氧化活性很低，与其他样品相比差异显著(P＜0.05)，结合图6可以看出，前10min并没有玉米肽洗脱下来，从2号样品开始收集液有一定的活性，而且活性集中在第2、3和4号样品。第5、6、7号样品间的抗氧化活性差异不显著(P＞0.05)。第8号样品与各个样品间的差异都比较显著(P＜0.05)。从图7可以看出，1%的玉米蛋白水解液具有19%的自由基清除率，等浓度的2号样品的自由基清除率达到37%，抗氧化活性提高了1倍，3、4号样品虽然活性也比较强，但是显著低于2号样品(P＜0.05)。结果表明采用XAD-7HP树脂具有吸附高活性玉米抗氧化肽的能力，而且解吸也比较容易。

3 结 论

本研究通过对大孔吸附树脂进行静态吸附能力的研究及动态吸附试验考证得出以下结论：通过不同型号树脂的静态吸附和解吸试验的研究，确定XAD-7HP树脂为最适吸附树脂，在此基础上研究了不同pH值对该树脂吸附能力的影响，结果表明pH3.0、6.0、7.0时吸附能力较强，但是由于水解液的pH值为7.0，将此pH值调节到3.0或者6.0，都会增加工业生产中的成本，因此选定最佳pH值为7.0。不同浓度解吸剂的解吸试验得出，70%的乙醇溶液解吸能力较强。本研究通过动态吸附试验来验证XAD-7HP树脂吸附能力的结果表明，该树脂分离纯化玉米抗氧化肽是可行的，而且解吸比较容易。并且在考察树脂处理后对玉米抗氧化肽活性影响的研究得出，该树脂可以将高活性的玉米抗氧化肽富集，使其抗氧化活性较原液提高了将近1倍。利用树脂进行分离纯化高活性玉米抗氧化肽具有一定的工业应用前景。

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Separation of Antioxidant Peptides from Maize by Macroporous Resin Adsorption

DIAO Jing-jing1，CAO Long-kui1,2,*
(1. Agri-food Processing Development Centre of Heilongjiang, Daqing 163319, China；2. College of Food Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

In this study, three types of macroporous resin were assessed for their adsorption and desorption capacity towards antioxidant peptides in the maize protein hydrolysate, prepared by alcalase hydrolysis, and XAD-7HP resin was found to be the most suitable resin among them. The static adsorption of XAD-7HP resin and the static desportion of antioxidant peptides with different desorption solvents were performed under different pH conditions. As a result, the optimal process parameters for the separation of antioxidant peptides were sample pH 7.0 and 70% aqueous ethanol as the desorption solvent. Antioxidant maize peptides were successfully separated by the dynamic adsorption of XAD-7HP resin, resulting in a 2-fold increase in DPPH free radical scavenging activity.

macroporous resin；antioxidant maize peptides；static adsorption；desorption capacity

TQ464.7

A

1002-6630(2011)16-0187-05

2010-11-02

大庆市高新区创新基金项目(DQGX08YF007)

刁静静(1981—)，女，助理研究员，硕士，研究方向为农产品加工与储藏。E-mail：diaojing--62@163.com

*通信作者：曹龙奎(1965—)，男，教授，博士，研究方向为农产品加工与储藏。E-mail：longkuicao@yahoo.com.cn