有机和常规红提葡萄附生菌的比较分析

刘万振，武婷婷，生吉萍，申 琳

有机和常规红提葡萄附生菌的比较分析

刘万振，武婷婷，生吉萍，申 琳*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

以伊犁金山葡萄庄园的红提葡萄为原料，通过比较常规葡萄和有机葡萄不同器官表面附生菌群的差异，旨在揭示常规和有机两种不同栽培模式对葡萄附生菌群的影响。葡萄附生菌的分离、筛选方法为平板培养法，微生物的计数方法为最大或然数法。结果显示：葡萄根部附生菌的群落总数最大(105CFU/mm2)，茎次之，果实最小(约102CFU/mm2)。在果实上，有机葡萄附生真菌种类多于常规葡萄，而附生细菌种类与之相反。除葡萄叶没有显著差异外，有机葡萄各器官(根、茎、果实)附生菌菌落总数均大于常规葡萄。初步表明，有机栽培可以更好地保持生态环境中微生物群落的生物多样性。

红提葡萄；有机食品；附生菌；食品安全

红提葡萄又名红地球葡萄，原产于美国，是美国加利福尼亚州立大学研究人员通过杂交实验培育而成的一个葡萄品种。自1986年引入该品种以来[1]，红提葡萄的种植在我国北方得到了大力推广。新疆伊犁地区深居内陆，受高山阻隔，海洋湿气很难进入，年平均降雨量较少。由于日照时间较长(年日照时间可达3000h左右)，葡萄光合作用积累的有机物多；较大的昼夜温差(9月份可高达17℃)又降低了葡萄夜间的呼吸作用强度，减少了有机物的消耗。所以在近乎天然的广袤的新疆大地上种植葡萄，无论在产量还是在质量上，都走在了全国前列[2]。

随着人们生活水平的提高，公众倡导的“天然、营养、健康”的消费理念正在推动着食品工业朝着绿色、有机食品的方向快速发展。目前国内葡萄以常规葡萄栽培为主，有机葡萄栽培悄然兴起。与常规栽培模式相比，有机栽培模式下的葡萄管理成本升高、单产降低，其单价高出常规葡萄数倍之多，但是由于没有农药残留，有机葡萄深受广大消费者，尤其是高收入群体的青睐。

植物附生菌(epiphyte)是一类附着在植物表面、以植物分泌物为营养的微生物类群。植物附生菌菌群复杂多样，在植物抗病、生长等过程中起着重要的作用。因生长在植物的表面，植物附生菌菌群的结构和数量易受地势、空气温度、湿度、空气流动、阳光等因素影响[3]；施肥、喷洒农药，也能影响附生菌的群落结构。

作为一种浆果类水果，葡萄在贮运过程中容易挤压擦伤，进而滋生腐败微生物，导致大面积腐烂。常见的葡萄病害包括白腐病、灰霉、霜霉病、白粉病等[4]。抑制采后葡萄病原菌生长、延长葡萄贮藏期一直是一个难点问题。以有机和常规红提葡萄为实验材料，研究葡萄各器官附生菌之间的关系、尤其是常规和有机葡萄之间附生菌在数量上的差异，探讨葡萄采后病害问题，可为采后葡萄贮藏保鲜提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

常规和有机红提葡萄根、茎、叶、果实，均采自新疆伊犁霍城县金山葡萄庄园(两实验材料选自同一地理环境，可排除自然环境的影响)。

1.2 培养基

营养琼脂(N)(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂粉15～20g、蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4)；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(P)(马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15～20g、蒸馏水1000mL，自然pH值)；酵母菌培养基(Y)(葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏5g、琼脂粉20g、蒸馏水1000mL，自然pH值)；高氏1号培养基(F)(可溶性淀粉20g、KNO31g、NaCl 0.5g、K2HPO4·3H2O 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、琼脂粉15～20g、蒸馏水1000mL，pH7.4～7.6)，以上培养基均在121℃湿热灭菌20min后使用[5]。

1.3 仪器与设备

LDZX-50KB高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；YT-CJ-2DN洁净工作台 北京亚泰科隆实验科技开发中心；VORTEX-5混匀器 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；SHP-450生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；DW-86L386立式超低温保存箱 青岛海尔医用低温科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 采样方法

为防止样品水分蒸发，早晨9点左右开始采样。

葡萄果实：手戴一次性无菌手套，选取果穗均匀、无病虫害和机械伤的果穗，小心剪下，并迅速装进无菌采样袋，4℃保存。

葡萄茎、叶：手戴一次性无菌手套，随机选取无病虫害的茎、叶，小心剪下后迅速装进无菌采样袋，4℃保存。

葡萄根：手戴一次性无菌手套，剪取不同年龄段的根，迅速装进无菌采样袋，4℃保存。

1.4.2 葡萄器官附生菌的计数方法

随机挑取规则的葡萄器官(葡萄果实以球体为模型、根和茎以圆柱体为模型、叶剪成长方形)，每种器官取3份，分别测量其表面积；然后将其放入盛有75mL无菌水的三角瓶中，用封口膜扎好；将三角瓶移至170r/min的摇床中振摇1h；迅速将葡萄器官转移至另一个盛有无菌水的三角瓶中，重复振摇3次，3次振摇后的菌液分别按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次梯度稀释，并分别平板涂布，重复3次；然后置于30℃培养箱中培养2d，按照最大或然数(must probable number，MPN)法计数。附生菌总数以前三次振摇后之和计。

1.4.3 葡萄器官附生菌种类计数方法

根据菌落形态差异，分别挑取各葡萄器官附生菌，并进行纯化，然后分别统计从不同器官分离的菌落形态不同的附生菌的种类。

1.4.4 统计学分析方法

用Origin 8.0软件对所得到的数据进行方差分析和邓肯检验，选取的显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 在不同培养基上有机和常规葡萄叶附生菌菌落总数比较

图1 有机和常规葡萄叶附生菌菌落总数比较Fig.1 Comparison of leaf epiphyte number between organic and common grapes

由图1可知，P培养基培养时，有机葡萄叶的菌落总数为120CFU/mm2，有机葡萄叶附生真菌菌落总数是常规葡萄叶的1.89倍，差异显著(P＜0.05)。N培养基培养时，有机葡萄叶的菌落总数为947CFU/mm2，是常规葡萄叶的1.25倍，差异显著(P＜0.05)。在Y和F培养基上培养时，常规葡萄叶和有机葡萄叶附生菌的菌落总数差异不显著(P＞0.05)。

2.2 在不同培养基上有机和常规葡萄果实附生菌菌落总数比较

图2 有机和常规葡萄果实附生菌菌落总数比较Fig.2 Comparison of fruit epiphyte number between organic and common grapes

由图2可知，在不同培养基上培养，有机葡萄果实附生菌菌落总数和常规葡萄果实附生菌差异显著(P＜0.05)。P培养基培养时，有机葡萄果实附生菌的菌落总数为34CFU/mm2，是常规葡萄果实的1.97倍。N培养基培养时，有机葡萄果实的菌落总数为532CFU/mm2，是常规葡萄的1.60倍。F培养基培养时，有机葡萄果实的菌落总数为351CFU/mm2，是常规葡萄果实的2.60倍。在Y培养基上培养时，有机葡萄果实为54CFU/mm2，是常规葡萄的2.87倍。有机葡萄果实附生菌菌落总数显著大于常规葡萄。

2.3 不同葡萄器官的附生菌菌落总数比较

表1 不同器官附生菌菌落总数比较Table 1 Comparison of epiphyte number on different organs of organic and common grapes

由表1可知，有机和常规葡萄相比，除葡萄叶外，葡萄根、茎、果实的附生菌菌落总数差异显著(P＜0.05)，有机葡萄的根、茎、果实附生菌菌落总数均大于常规葡萄，其中根部差异最大，有机葡萄根部附生菌为常规葡萄的6.73倍。葡萄果实和葡萄叶附生菌菌落总数较少，推测附生菌的菌落总数可能与器官表面的粗糙程度有关。器官越粗糙，比表面积越大，微生物越容易黏附和滋生。而葡萄根附生菌菌落总数是其他器官的数十倍，分析可能是根围微生物大量黏附在根表面的原因。喷洒农药和施用化肥，会影响微生物的正常生命活动[3-5]，这也是造成有机葡萄器官附生菌数量大于常规葡萄的重要原因。

图3 不同葡萄器官附生细菌种类比较Fig.3 Comparison of epiphyte bacterial species on different organs of organic and common grapes

图4 葡萄器官附生真菌种类Fig.4 Comparison of the numbers of epiphyte fungi species on different organs of organic and common grapes

图5 有机葡萄和常规葡萄附生菌种类比较Fig.5 Comparisons of the number of epiphyte fungi and bacterial species on different organs of organic and common grapes

由图3可知，有机葡萄茎和葡萄根附生细菌的种类少于常规葡萄，而有机葡萄果实和葡萄叶附生细菌种类多于常规葡萄。图4说明，有机葡萄果实和葡萄根附生真菌的种类多于常规葡萄。图3、4显示，常规葡萄茎附生细菌种类最多，达15种，常规葡萄根次之，为14种，常规葡萄果实最少，仅为5种；在有机葡萄器官中，附生细菌的种类由葡萄根、葡萄茎、葡萄叶和葡萄果实呈递减趋势。与之相反，附生真菌种类最多的是有机葡萄果实，其在常规葡萄果实表面的种类为6种，在葡萄茎和根部较少。由此推测，附生菌种类除与器官粗糙程度有关外，也可能与器官表面的微环境有关。附生菌在植物器官表面营寄生生活，而各器官表面不尽相同的分泌物，对微生物起到一定的选择和富集作用，进而影响附生微生物的种群分布[3]。图5表明，有机葡萄附生真菌种类多于常规葡萄，而细菌种类比常规葡萄少。

3 讨 论

植物的根、茎、叶、果实等表面，黏附着大量的细菌[6]、真菌[7]、古菌等附生菌[3]，这些附生菌可以通过水平基因转移[8]、和植物互惠共生[9-10]、转变成内生菌、转变成植物病原菌或者成为植物腐生菌等方式与植物相互作用[3]。

葡萄样品采自于伊犁霍城县金山葡萄庄园，由于处于同一环境，排除了气候等外界条件的干扰。有机葡萄器官附生菌群落总数大于常规葡萄，附生真菌种类较多，细菌种类略少于常规葡萄，微生物种类与微生物群落总数之间无相关关系。Granado等[9]研究金冠苹果在有机农业体系(organic farming system)和复合农业体系(integrated farming system)下附生菌之间的关系时发现，有机苹果附生真菌包括22个类群，高于非有机模式下的真菌类群数。此外，葡萄的栽培方式可能影响器官附生菌群的变化，施肥和喷洒农药对微生物种群结构及数量影响较大[3,9]。

附生菌通过产生胞外分泌物，在器官表面形成一种生物膜，黏合在植物器官表面。附生菌的这种生存方式，既可以防止菌体水分过多蒸发[3]，又增强了其对农药的抵抗能力[11]。无论有机葡萄还是常规葡萄，葡萄果实附生菌的群落总数都最小，葡萄根表面的微生物群落总数最多，根部的附生菌远远大于其他器官。附生细菌种类最少的葡萄果实，真菌种类却最多，说明微生物种类可能与器官表面的微环境和器官的外渗物质类型有关[8]。

张学君[12]研究发现，苹果附生菌中存在着多种对苹果常见病症——轮纹病和炭疽病起拮抗作用的微生物。有机栽培的苹果表面附生的丝状真菌的类群和数量均比非有机栽培的苹果丰富，推测可能与栽培模式有关，丰富的附生真菌可能会抑制苹果病原菌，利于病害的防治[9]。附生菌可以通过营养竞争、占位效应、产生抑菌物质等方式抑制表面病原菌的繁殖，而常规栽培模式中的喷洒农药和施用化肥等，会改变附生菌原始的群落组成，打破其群落平衡，在采摘之后，这种群落的不平衡可能会导致果实的过早腐烂。

[1]赵胜建. 红地球葡萄国内外栽培现状及特点[J]. 北方园艺, 1998(5): 30-31.

[2]生吉萍, 申琳, 吴文良, 等. 伊犁地区绿色-有机葡萄保鲜储运关键技术问题与对策[J]. 新疆农业科学, 2008(增刊3): 97-100.

[3]ANDREWS J H, HARRIS R F. The ecology and biogeography of microorganisms on plant surfaces[J]. Annual Review of Phytopathology, 2000, 38: 145-180.

[4]陈星玲, 母勇, 杨小乐. 红提葡萄主要病害及防治[J]. 农村经济与科技, 2003, 14(7): 24-25.

[5]周德庆. 微生物学实验教程[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 2006: 372-375.

[6]YRJA K, MANCANO G, FORTELIUS C, et al. The incidence of Burkholderia in epiphytic and endophytic bacterial cenoses in hybrid aspen grown on sandy peat[J]. Boreal Environment Research, 2010, 15 (1): 81-96.

[8]KROER N, BARKAY T, SORENSEN S, et al. Effect of root exudates and bacterial metabolic activity on conjugal gene transfer in the rhizosphere of a marsh plant[J]. FEMS Microbiology Ecology, 1998, 25(4): 375-384...

[9]GRANADO J, THURIG B, KIEFFER E, et al. Culturable fungi of stored , golden delicioupple fruits: a one-season comparison study of organic and integrated production systems in Switzerland[J]. Microbial Ecology, 2008, 56(4): 720-732.

[10]PRESTON G M, HAUBOLD B, RAINEY P B. Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis[J]. Current Opinion in Microbiology, 1998, 1(5): 589-597.

[11]COSTERTON J W, STEWART P S, GREENBERG E P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections[J]. Science, 1999, 284: 1318-1322.

[12]张学君, 徐盈, 王建营. 苹果表面微生物数量及其与两种主要病菌的关系[J]. 果树科学, 1995, 12(4): 232-236.

Comparative Analysis of Epiphyte between Organic and Common Red Globe Grapes

LIU Wan-zhen，WU Ting-ting，SHENG Ji-ping，SHEN Lin*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Both organic and conventional red globe grape were sampled from Jinshan vineyard in Yili. The effect of different farming models of conventional and organic farming models on the epiphyte distribution was studied preliminarily in current paper by comparing the epiphytic biodiversity in grape organs. The agar-plate culture method was used for the microbial isolation, and the most-probable-number (MPN) was used for the enumeration of epiphyte population. The result was as follows: the largest number of epiphytes located on the root (up to 105CFU/mm2), and the stem took second place, and the smallest on fruit (about 102CFU/mm2). Besides, the amount of epiphytic fungi species of the organic grape was slightly higher than that of conventional grape; on the contrary, the amount of epiphytic bacteria species of the organic grape was lower. The number of epiphytic microorganisms of organic grape was more than that of conventional grape on all organs except leaf. The organic farming was shown to be more effective to keep the biodiversity of microbial communities in ecological environment.

red globe grape；organic food；epiphyte；food safety

TS201.3

A

1002-6630(2011)03-0126-04

2008-08-08

国家自然科学基金项目(30972065；30671471)；国家公益性行业(农业)科技项目(200803033)；

“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD22B07-01；2007BAC15B05-04；2008BADAIB07)

刘万振(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：liuwanzhen123@163.com

*通信作者：申琳(1964—)，男，教授，博士，研究方向为农副产品综合利用。E-mail：shen5000@gmail.com