壳聚糖金属配合物对黑曲霉的抑制活性研究

冯小强，李小芳，杨 声,2，伏国庆，王廷璞

壳聚糖金属配合物对黑曲霉的抑制活性研究

冯小强1，李小芳1，杨 声1,2，伏国庆3，王廷璞1

(1.天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃 天水 741001；2.定西师范高等专科学校化学系，甘肃 定西 743000；3.天水市中医医院，甘肃 天水 741001)

通过观察黑曲霉菌丝体的生长及孢子萌发情况，考察壳聚糖(CS)及壳聚糖锌(CS-Zn)、壳聚糖镍(CS-Ni)的抗真菌性能。结果表明：壳聚糖、壳聚糖锌和壳聚糖镍对黑曲霉孢子萌发和菌丝体生长均具有明显抑制作用，且壳聚糖金属配合物的抑菌效果比壳聚糖本身更强，其中壳聚糖镍最强。壳聚糖镍对黑曲霉的抑菌活性受壳聚糖分子质量、环境pH值、质量浓度因素的影响较大。分子质量为5kD的CS制备的CS-Ni抗真菌效果最好；CS-Ni抑菌效果在pH3～7.5时随pH值降低而增强；随CS-Ni质量浓度(0～0.75mg/mL)的增加而增强。

壳聚糖金属配合物；黑曲霉；抗菌

壳聚糖(chitosan，CS)是甲壳素脱乙酰基后的产物，主要存在于虾、蟹、蛹及昆虫等动物外壳以及菌类、藻类植物的细胞壁中。大量的研究证实，壳聚糖及其衍生物具有广谱的抗菌性能，可抑制多种细菌和真菌的生长[1-2]。壳聚糖残基在C2位上的NH2基，C3位上的—OH是典型的Lewis碱性基团，从构象上说都是平伏键，这种特殊的结构使它们对具有一定离子半径的某些金属离子具有很强的螯合作用。目前，对于壳聚糖金属配合物抑菌活性的研究主要集中在对细菌的抑制[3-5]，而对抑制真菌生长的报道很少。黑曲霉(Aspergillus niger)属半知菌亚门真菌，能使水分较高的粮食霉变。本实验拟研究壳聚糖、壳聚糖锌(CS-Zn)、壳聚糖镍(CS-Ni)对黑曲霉生长的影响，旨在为明确壳聚糖及其金属配合物的抑制真菌机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑曲霉(Aspergillus niger)由天水中医医院提供；壳聚糖(50kD，纯度98%) 浙江玉环县壳聚糖有限公司；壳聚糖(5、10kD) 济南海德贝海洋生物工程有限公司；CS-Ni、CS-Zn制备方法参看文献[6]，用0.3% HCl溶液溶解。

1.2 仪器与设备

UV-2450型紫外光谱仪 日本岛津公司；LDZX 40CI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；生化恒温培养箱 常州国华电器有限公司；SNCJ1BU无菌操作台 苏净集团安泰公司；JEM-1230透射电子显微镜 日本JEOL公司；COIC XSZ-D倒置显微镜 重庆光学仪器厂。

1.3 对黑曲霉菌丝体径向生长的影响

将真菌A.niger接种于马铃薯琼脂培养基(PDA)，在27℃活化72h，用已灭菌的打孔器打直径为0.8cm的菌片备用。3.0mL 分子质量为50kD 的CS以及制备的CS-Zn、CS-Ni与一定量PDA混合，使CS、CS-Zn、CS-Ni的最终质量浓度均为0.5mg/mL，以3.0mL 0.3%HCl溶液作为空白对照，灭菌后倒平板，冷却后在培养皿中央贴一菌片，置于恒温培养箱27℃培养，观察A.niger菌丝体生长情况，直到对照组黑曲霉菌落几乎长满培养皿为止。

1.4 对黑曲霉孢子萌发的影响

取直径为0.8cm的黑曲霉菌片，浸入已灭菌的15mL分子质量为50kD 的CS以及制备的CS-Zn、CS-Ni溶液中，CS、CS-Zn、CS-Ni的质量浓度分别为0.75、0.5、0.25mg/mL。空白对照为15mL 0.3% HCl溶液，平行3次。在27℃用25W日光灯照射培养12～24h，菌片边缘的孢子用倒置显微镜观察。以孢子芽管长度超过孢子长径视为萌发，按式(1)和(2)计算CS、CS-Zn和CS-Ni处理的孢子萌发率和对孢子萌发的抑制百分率[7]。

1.5 CS-Ni抑制黑曲霉生长的抑制率

按式(3)计算CS-Ni抑制黑曲霉生长的抑菌率[8]：

式中：Δ表示培养前后的差值，已经对培养期间水分损失做了补偿；Δ对照培养基质量：未加CS-Ni的培养基培养96h前后的质量差；ΔCS-Ni培养基质量：加CS-Ni的培养基培养96h前后的质量差。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖及其金属配合物对黑曲霉菌丝体径向生长的影响

CS、CS-Zn及CS-Ni对黑曲霉生长的影响如图1所示。当黑曲霉培养5d时，发现对照组黑曲霉菌落的径向生长十分旺盛，菌落几乎覆盖了整个培养皿，有大量呈炭黑色的孢子生长繁殖。在培养基中加入CS或CS-Zn、CS-Ni后，黑曲霉菌落的径向生长均比对照组小，且菌片直径从CS、CS-Zn到CS-Ni逐渐减小，表明CS-Ni对黑曲霉生长抑制作用最强，CS-Zn次之，C S最弱。

图1 壳聚糖及其金属配合物对黑曲霉生长的影响Fig.1 Effect of CS, CS-Zn and CS-Ni on the growth of A. niger

2.2 对黑曲霉孢子萌发的影响

在所选定的质量浓度0.25～0.75mg/mL范围内，各质量浓度的CS、CS-Zn和CS-Ni对黑曲霉孢子萌发均表现出一定的抑制作用，并且随质量浓度的增加，对孢子的抑制效果显著增大，如图2所示。CS、CS-Zn和CS-Ni对黑曲霉孢子萌发均具有明显抑制作用，其中CS-Ni效果最显著。24h后，对照的孢子萌发率99.5%；而CS-Ni的处理中，质量浓度达到0.25mg/mL时，黑曲霉孢子的萌发率为15%，即对孢子萌发的抑制率达到85%，0.75mg/mL时几乎完全抑制孢子萌发。

图2 CS、CS-Zn和CS-Ni对黑曲霉孢子萌发的影响Fig.2 Effect of CS, CS-Zn and CS-Ni on the germination of A. niger spore

李美芹等[7]发现壳聚糖能抑制番茄叶霉病菌分生孢子萌发。通过光镜观察发现：经过壳聚糖处理后未萌发的孢子呈现不同程度的质壁分离或畸形等异常现象，荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的壳聚糖处理，在荧光显微镜下观察到孢子周围包被着一层壳聚糖。可见，壳聚糖对孢子萌发的影响，一方面可能通过渗透势的改变而实现；另一方面，也可能是通过壳聚糖的包被而影响孢子的活力。

从对黑曲霉菌丝体径向生长和孢子萌发的影响结果发现，CS-Ni对黑曲霉孢子萌发和菌丝体生长影响效果最强，故以下实验选择CS-Ni，考察了壳聚糖分子质量、环境p H值、浓度因素对其抗真菌活性的影响。

2.3 CS分子质量对CS-Ni抑制黑曲霉生长的影响

图3 CS分子质量对CS-Ni抑菌性能的影响Fig.3 Antifungal activity of complexes of Ni with CS with different molecular weights

由不同分子质量的CS制备的CS-Ni和PDA混合，使CS-Ni的最终质量浓度为0.5mg/mL，灭菌后倒平板，在培养皿中央贴一黑曲霉菌片，27℃恒温培养测量菌丝体的直径。图3可以看出，分子质量是影响CS-Ni对黑曲霉抑制作用的重要因素。当PDA培养基中加入CS-Ni后，随着培养时间的延长，菌丝体直径逐渐增大，但是菌丝体的直径均比对照小，CS分子质量从5～50kD，对应的菌丝体直径逐渐增大，表明随CS分子质量的增大，CS-Ni对抑制黑曲霉菌丝体生长的能力减弱。在本实验中，分子质量为5kD的CS制备的CS-Ni抗真菌活性最强。故以下实验选用分子质量为5kD的CS制备的CS-Ni，考察了环境pH值、质量浓度对其抗真菌活性的影响以及抗真菌机理。

2.4 CS-Ni质量浓度对抑制黑曲霉生长的影响

图4 CS-Ni质量浓度对黑曲霉生长的影响Fig.4 Effect of CS-Ni concentration on the growth of A. niger

如图4所示，当黑曲霉培养5d时，对照黑曲霉菌落几乎长满整个培养皿，而在PDA中加入CS-Ni后，黑曲霉菌丝体的直径均小于对照，且随着CS-Ni质量浓度的逐渐增加，黑曲霉菌丝体直径逐渐减少，当CS-Ni的质量浓度为0.75mg/mL时，黑曲霉菌丝几乎无扩充生长，说明CS-Ni对黑曲霉的最小抑菌质量浓度是0.75mg/mL。

2.5 pH值对CS-Ni抑制黑曲霉生长的影响

培养基的pH值分别调为3、4.5、5.5、6.5、7.5时，CS-Ni对黑曲霉的抑菌率分别为100%、90%、75%、45%、21%，如图5所示，表明CS-Ni对黑曲霉的抑菌率随pH值的增大而减小，当pH6.5时，抑菌率急剧降低。

图5 pH值对CS-Ni抑制黑曲霉生长的影响Fig.5 Effect of pH on anti-Aspergillus niger activity of CS-Ni

2.6 CS-Ni处理前后黑曲霉的形貌变化

图6 CS-Ni对黑曲霉超微结构的影响(×30000)Fig.6 Effect of CS-Ni on the ultra-structure of Aspergillus niger (×30000)

由图6a可知，黑曲霉的细胞膜和细胞壁清晰可见，外围孢子繁殖旺盛。由图6b可知，壳聚糖分子质量为5kD时，制备的CS-Ni与黑曲霉作用后，发现黑曲霉孢子生长量比对照组明显减少，胞浆内容物稀疏，空隙明显扩大，结构分布异常，核内出现了异物，可能有一部分CS-Ni进入了黑曲霉的内部，影响了核仁的正常生理功能。

3 结 论

CS、CS-Zn、CS-Ni能抑制黑曲霉孢子萌发及菌丝体生长，且CS-Zn和CS-Ni的抑菌效果比CS本身更强，其中CS-Ni最强。CS-Ni对黑曲霉的抑菌活性受CS分子质量、环境pH值、质量浓度的影响较大。分子质量为5kD的CS制备的CS-Ni抗真菌效果最好；CS-Ni抑菌活性随环境pH值(pH3～7.5)的降低而增强；随CS-Ni质量浓度(0～0.75mg/mL)的增加而增强。

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Anti-Aspergillus niger Activity of Metal/Chitosan Complexes

FENG Xiao-qiang1，LI Xiao-fang1，YANG Sheng1,2，FU Guo-qing3，WANG Ting-pu1
(1. College of Life Science and Chemistry, Tianshui Normal University, Tianshui 741001, China；2. Department of Chemistry, Dingxi Teachers College, Dingxi 743000, China；3. Traditional Medical Hospital of Tianshui, Tianshui 741001, China)

Chitosan and metal/chitosan complex were evaluated comparatively for their anti-Aspergillus niger activity based on the mycelial growth and spore germination of the fungus. The results showed that both chitosan and metal-chitosan could effectively inhibit the mycelial growth of A. niger and its spore germination, while chitosan displayed lower antifungal activity than its complexes with Zn or Ni, and chitosan/ Ni complex showed the strongest antifungal activity. This biological activity of chitosan was largely influence by its molecular weight and concentration as well as environmental pH. The complex between chitosan with 5 kD molecular weight and Ni had the best inhibitory effect on A. niger. The inhibitory effect of chitosan/Ni complex revealed a change trend opposite to that of pH ranging from 3 to 7.5, but increased with increasing concentration from 0 to 0.75 mg/mL.

metal/chitosan complex；Aspergillus niger；antifungal activity

TQ929.2

A

1002-6630(2011)03-0152-04

2010-05-06

天水师范学院物理无机化学重点学科项目(ZD0840)；天水师范学院中青年教师科研资助项目(TSA1003)

冯小强(1979—)，男，讲师，硕士，研究方向为天然高分子生物活性。E-mail：fengxiaoq04@lzu.cn