VEGF和P53在翼状胬肉中的表达

郑琦 郑 根主 许燕红

翼状胬肉是指球结膜及纤维血管组织呈翼状侵入角膜浅层，由一种结膜组织的增殖变性引起的病变。翼状胬肉是我国常见的眼表疾病，其患病率较高，达到2% ～5%，患病总人数达2 000 万 ～ 5 000 万［1，2］。血管内皮生长因子(VEGF)是目前研究发现的功能最强的血管形成促进因子，它可以增强微血管的通透性，刺激内皮细胞分裂，增加组织因子和某些蛋白酶的产生，为成纤维细胞和血管内皮细胞的迁入提供条件基质，为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养。紫外线致球结膜变性，结膜上皮细胞抑癌基因p53突变，细胞周期调控基因p21/p27kip1表达下降导致球结膜上皮细胞周期紊乱，结膜上皮细胞的端粒酶活性异常增高，凋亡调控基因Bc1/Bax比值上调导致变性结膜上皮细胞具有无限增殖活性;有研究认为翼状胬肉是结膜组织正常凋亡过程失败的结果。本项目研究VEGF和P53在翼状胬肉中表达，通过对VEGF和P53在翼状胬肉中的表达的研究，为探索翼状胬肉的发病机制提供理论依据，同时为临床药物研究提供理论支持，从而对降低翼状胬肉的发生率及复发率也将具有一定指导意义，为预防治疗翼状胬肉提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选 择本院2009年1至11月门诊初发的进行期翼状胬肉手术患者中选标本30例作为病例组(术后经病理检查确诊是翼状胬肉的标本)其中男15例，女15例;年龄33～68岁，平均年龄(48.0±5.0)岁;平均病程11个月。同期正常结膜(斜视手术患者结膜)30例作为对照组，其中男14例，女16例;年龄34～68岁，平均年龄(47.4±2.3)岁。所有病例均排除其他角膜、结膜疾患，排除青光眼、虹膜炎及其他眼底疾患，排除全身疾患。

1.2 试剂与仪器 免 疫组化试剂:多聚赖氨酸、一抗(VEGF、P53、河北博海生物工程开发有限公司分装美国SANTA CRUZ公司产品)、SP、Dab(购于河北博海生物工程开发有限公司)仪器设备显微镜:日本奥林巴斯 BX51T-PHD-J11;CMOS:日本奥林巴斯;多功能真彩色细胞图象分析管理系统:美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus;切片机:德国莱卡RM2015;离心机:北京离心机厂LDZ5-2型;电子天平:瑞士METTER AE100型;移液器:德国EPPENDORF;干燥箱:日本三洋MIR-153型;低温冰箱:日本三洋MDF-382E型;恒温水浴箱:江苏太仓医用仪器厂 DSHZ-300型;医用微波炉:浙江临安爱迪仪器厂YWY781B型。

1.3 方法 取试验组和对照组标本固定，脱水，包埋组织块;HE染色。再行取材固定和包埋、切片，脱蜡、入水，加第一抗体，加第二抗体，加辣根酶标记链霉卵白素工作液，二氨基联苯胺(DAB)显色，复染，显微镜观察，选择病例组和对照组的阳性和阴性组织相，进行×100和×400的显微照相，选择有意义的组织相，经登录、编号、采集、分析、读取数据、最后存盘。

1.4 结果判断标准 VEGF结果判定标准:以血管内皮和细胞浆内出现棕色或棕黄色颗粒为阳性染色，以细胞浆内无或少量棕色或棕黄色颗粒为阴性染色。P53结果判定标准:光镜下观察，细胞核呈浅黄色或深棕色染色的细胞为P53阳性细胞;细胞浆或细胞膜呈浅黄色或深棕色的细胞为假染色以及无棕黄色染色的细胞均视为P53阴性细胞。表达的强弱均以IHS为准，免疫组化评分(immunohi-stochemical scores，IHS)方法见参照文献［3］，结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分:a为阳性细胞百分比(无阳性细胞=0，阳性细胞占1%～10%=1，11% ～50%=2，51% ～80%=3，81% ～100%=4)，b为阳性细胞染色强弱(阴性=0，弱阳性=1，中度阳性=2，强阳性=3)，a，b两项乘积即为该例组织的IHS。阳性细胞数表示阳性细胞占总体细胞的比例。每张切片在高倍显微镜下(×400)随机选择5个视野，计算每个视野阳性细胞率，取平均值作为该标本的阳性细胞率。设置b的原因是可能同样的阳性细胞数会出现显色不同。HE染色结果:HE结果判定标准:细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。

1.5 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件，研究病例组与正常组间均采用染色强度及染色阳性率乘积的IHS评分，成组设计两样本比较的秩和检验，两样本比较的秩和检验和Spearman秩相关检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下比较 对照组即正常结膜分为上皮层和基质层。上皮层由3～5层细胞组成，表层为扁平细胞，中层为多边形细胞，基底层为立方形或柱形细胞。基质层为疏松结缔组织，其间有散在的毛细血管，少量成纤维细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。病例组胬肉伴有上皮细胞增生，并见上皮囊肿，上皮增生变厚，厚薄不均，上皮下见较丰富的毛细血管，伴睑裂斑改变，符合翼状胬肉病理改变。

2.2 免疫组化 (1)病例组与对照组的VEGF:VEGF蛋白主要定位在血管内皮和细胞浆表达细胞浆呈现棕色，胞核无着色，阳性部位主要在上皮中的杯状细胞。2组VEGF IHS数值比较:病例组IHS的平均秩次为44.60，对照组IHS的平均秩次为16.40，二者差异有统计学意义(P ＜0.01)。(2)病例组与对照组的P53:P53抗体主要在细胞核表达，呈现棕色。2组P53 IHS数值比较:病例组IHS的平均秩次为15.88，对照组IHS的平均秩次为45.12，Z 值为 －6.626，P 值为 0.001，二者差异有统计学意义(P＜0.01)。(3)病例组VEGF和P53的比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结果显示VEGF和P53均在翼状胬肉中均为高表达。VEGF和P53在翼状胬肉中的表达具有一定相关性(r= －6.626，P ＜0.01)。

3 讨论

翼状胬肉形成是多因素参与的复杂病理过程，主要成分是大量增生的成纤维细胞，并由其导致相应的病变，而细胞因子在成纤维细胞增生方面起着重要的作用。有研究表明紫外线照射的增加会引起Bowman’s膜的生物学发生改变，产生刺激翼状胬肉生长的免疫因子，最具代表性的就是血管刺激生长因子(VEGF)，可以导致大量血管和成纤维细胞的增生和退变。

翼状胬肉是眼科常见病，翼状胬肉的复发率高，生长相对顽固。过去被认为是一种结膜组织的变性疾病，研究表明翼状胬肉是一组织增生性结膜疾病，其发病机制仍不十分清楚，可能与细胞异常增殖和凋亡异常有关。随着分子生物学的发展，对翼状胬肉的发病机制有了新的认识，VEGF是目前发现的功能最强的血管形成促进因子，它具有增强微血管的通透性，刺激内皮细胞分裂，增加组织因子和某些蛋白酶的产生等作用。VEGF不仅能特异性地刺激血管内皮细胞的有丝分裂、促进血管形成、抑制血管内皮细胞凋亡、诱导血管平滑肌细胞的迁移，能促进血管平滑肌细胞合成和分泌基质金属蛋白酶、加速基质降解及趋发炎性细胞，同时还具有促血管通透作用，使血管内大分子物质溢出，从而有利于血管外基质的形成，为血管内皮的迁移及血管形成提供物质，最终促使新毛细血管生成并促进功能成熟［4，5］。在紫外线氧化应激引起的DNA损伤中，P53基因是最常见的被损伤的基因之一。P53基因参与细胞的DNA的修复与合成，调节细胞的分化、凋亡，控制细胞的周期，是引起人类肿瘤最常见的突变基因。P53基因产物组织细胞进入S期，参与抑制细胞增生，并促使DNA损伤的细胞进入程序化死亡。突变型P53基因可翻译成异常P53蛋白，并在细胞内聚集胬肉组织上皮细胞胞质中P53蛋白呈阳性表达，且胬肉周围看似正常的结膜上皮亦表达阳性，上皮下组织则为阴性。胬肉上皮细胞异常表达P53蛋白，提示胬肉上皮细胞呈增生活跃状态。户外工作者的P53蛋白表达明显增多，提示紫外线可引起P53蛋白的异常表达［6］。本研究应用免疫组化学染色，翼状胬肉患者标本P53蛋白表达阳性，而正常结膜均为阴性。有研究认为P53基因是十分重要的肿瘤抑制基因，其与细胞的生长、分化关系密切，50%的肿瘤组织P53蛋白表达增加［7］，一些癌前期病变及良性增生性组织也表达P53蛋白［8］。翼状胬肉上皮细胞异常表达P53蛋白提示翼状胬肉上皮细胞的生物学特征不同于正常结膜，其上皮细胞呈增生活跃状态。以往对翼状胬肉的研究表明，其上皮下成纤维细胞增生活跃，结合本试验结果，我们认为翼状胬肉应为一种良性增生性疾病。

组织学上，翼状胬肉是由萎缩的结膜上皮和增生肥大的血管化组织及弹性退变结缔组织构成。近年来的研究表明，翼状胬肉更趋向是一种组织增生性疾病，并可能与细胞的增殖与凋亡有关。翼状胬肉组织超微结构研究表明，弹性纤维与胶原纤维的增生和变性是翼状胬肉较为突出的病理改变，临床表现为新生的组织不断生长、增厚，并逐渐侵入角膜，手术切除后易复发，此特点与肿瘤组织相似，而肿瘤发生发展的重要原因是细胞异常增殖和凋亡失衡［9－11］。

我们研究与翼状胬肉发生发展相关的细胞因子，为预防和控制翼状胬肉的发生发展提供理论依据，为生物科技研制相关治疗翼状胬肉的试剂提供一定的帮助，同时为相关职业的职业病的防护提供临床干预方法。通过对VEGF和P53在翼状胬肉中的表达及相关性研究，为研究翼状胬肉的发病机制提供理论依据;选择性的VEGF和P53拮抗药物可以有效减少翼状胬肉的发生，为临床药物研究提供理论支持。

尽管研究显示有很多相关环境因素造成翼状胬肉的发生发展，但是翼状胬肉的发病记住仍不十分清楚，研制临床药物需要多种因子的拮抗剂及多种因子的协同剂，还需要大量的临床药物试验，今后仍需要大样本的、前瞻性的队列研究，以便更为深入的揭示其发病机制。

1 马科，徐亮，张士元，等.北京特定地区翼状胬肉患病率的流行病学调查.中华眼科杂志，2005，41:63-64.

2 阎启昌，刘忠鑫，邸悦，等.三亚地区翼状胬肉发病与紫外线暴露时间相关关系研究.中华医学杂志，2006，119:1308-1310.

3 Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al.Cox-2 is expressed in humanpulmonary，colonic，and mammary tumors.Cancer，2000，89:2637-2645.

4 张涛，李红兵，慕玉东.VEGF的生物活性及其在心血管疾病中的应用.辽宁医学杂志，2006，20:27-28.

5 Gebhardt M，Mentlein R，Schaudig U，et al.Differential expression of vascular endothelial growth factor implies-the-limbalorigin-of-pterygia.Ophthalmology，2005，112:1023-1030.

6 Tan DT，Tang WY，Liu YP，et al.Apoptosis related gene expression in normal conjunctive and pterygium.Br J Ophthalmol，2000，84:212-216.

7 伍新尧，罗权超，杨英浩主编.基因诊断原理与临床.第1版.广州:中山大学出版社，1995.114.

8 Moss SF.REVIEWARTICLE:celllularmarkersinthegastricprecancerous process Alimen Pharmacol.THER，1998，12 Suppll:91-109.

9 Tsai YY，Chang KC，Lin CL，et al.p53 Exp ression in pterygium by immunohistochemical analysis:a series report of 127 cases and review of the literatue.Cornea，2005，24:583-586.

10 王勇，张明昌，胡义珍.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27kip1在翼状胬肉中的表达.眼科新进展，2005，25:52-53.

11 Park TK，Jin KH.Telomerase activity in p terygeal and normal conjonctival epithelium.Korean J Ophthalmol，2000，14:85-89.