不同缺血时段大鼠心肌组织中Nanog的表达变化及意义

(1新乡医学院第一附属医院，河南卫辉 453100;2新乡医学院基础医学院;3新乡医学院组织再生重点实验室)

心肌缺血可导致心肌细胞缺氧，引起某些核转录因子的激活，影响干细胞分化。目前研究发现［1］，作为一种调节干细胞自我更新的核转录因子Nanog在心肌缺血的发病机制中的起重要作用。Nanog是一种存在于哺乳动物多潜能细胞和发育中的胚胎细胞中的同源结构域蛋白，它不仅对胚胎细胞的形成特别重要，而且对体细胞多潜能表达也起调节作用［2］。2009年8月～2010年3月，我们采用RT-PCR和Western blot法观察急性心肌缺血损伤大鼠心肌组织中Nanog mRNA和蛋白表达变化，并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理 选用健康SD雄性大鼠30只(河南省实验动物中心提供)，体质量180～220 g。随机分为假手术组(正常组)和Q1、Q2、Q3、Q4组，各6只。后四组采用冠状动脉前降支结扎法建立心肌缺血模型［3］，以结扎后心前壁颜色变暗和ST段明显抬高0.15 mV确定建模成功。正常组除不结扎冠状动脉前降支外，余相同。

1.2 主要试剂 RT-PCR试剂盒，Nanog兔抗鼠多克隆抗体，辣根酶标记山羊抗兔IgG，PVDF膜(孔径0.45 μm，ECL-Western blot试剂盒等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 各组心肌组织中Nanog mRNA及蛋白检测

1.3.1 各组心肌组织中Nanog mRNA检测 取正常组心肌组织，Q1、Q2、Q3、Q4组分别于心肌缺血2、6、12、24 h时取心肌组织，采用 RT-PCR 法检测。先提取组织中的总RNA，逆转录合成cDNA，半定量RT-PCR扩增 Nanog、β-actin cDNA片断。Nanog上下游引物序列分别为5'-ATGCCTGTGATTTGTGGGCC-3'、5'-GCCAGTTGTTTTTCTGCCAC-3'，β-actin上下游引物序列分别为5'-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'、 5'-GCTCAGGATCTTCATGAGGT-3'。PCR反应条件:95℃预变性3 min，94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。予以1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果拍照后用图像分析灰度扫描，进行半定量分析。……