人胆固醇酯水解酶真核表达载体的构建及U937细胞系的转染

顾立学，罗俊生，王 瑞，冯 旭，关 宁，霍晓川

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁 锦州 121001)

缺血性脑血管病(ICVD)的主要病理基础是脑供血血管的动脉粥样硬化(AS)性狭窄［1］。AS斑块的显著特征是脂质在巨噬细胞中蓄积形成泡沫细胞［2］。如何抑制AS的形成及发展是防治ICVD的重要研究方向。人胆固醇酯水解酶(hCEH)主要作用是催化胆固醇酯(CEs)水解为游离胆固醇(FC)，从而促进胆固醇外流，减少CEs在细胞内蓄积，从而减少泡沫细胞形成。研究发现hCEH的表达水平与AS的易感性呈负相关［3］。可见，hCEH在AS的形成过程中起到关键性作用。2009年12月～2010年10月，我们构建了hCEH绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-hCEH，通过转染单核巨噬细胞，可以特异性上调其pEGFP-N1-hCEH表达，为进一步研究hCEH的功能奠定基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 人肝细胞L-O2(北京酶阿查生物控股有限公司)，Trizol Reagent(Invitrogen公司)，E.coli DH5α、pMD19-T 克隆载体试剂盒、限制性内切酶 EcoRⅠ和 SalⅠ、RNA PCR Kit ver.3.0 反转录试剂盒、DNA Ladder Marker(TaKaRa公司)，凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒(Axygenbio公司)，FUGENE HD转染试剂(罗氏公司)。真核表达载体pEGFP-N1、人单核巨噬细胞株U937(辽宁医学院科学实验中心实验室)。

1.2 实验方法

1.2.1 RNA提取及cDNA扩增 根据GenBank公布的hCEH基因［AC:AY268104编码区序列设计引物(由大连TakaRa公司合成)］。上游引物序列:5＇-GTCAGAATTCACCATGTGGCTCCGTGCCTTTATC-3＇(内含EcoRI位点GAATTC、Kozac序列ACC和起始密码子 ATG;下游引物序列:5＇-TGTAGTCGACCACAGCTCTATGTGTTCTGTCTGG-3＇(内含 SalⅠ位点GTCGAC，为实现基因与表达载体的融合表达，终止密码子由TGA突变为TGG)。

采用Trizol一步法从L-O2中提取总RNA。测定浓度，并根据A260/A280分析RNA样品纯度。10g/L琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的完整性。用提取的总RNA反转录合成cDNA，行PCR，反应产物回收、纯化后，取5 μl用1%琼脂糖凝胶电泳检测。……