AAV-AS联合环磷酰胺治疗大鼠皮下胶质瘤效果观察

王 冠,黄 楹,冯珂珂,李耀华,王增良

(1天津中医药大学第二附属医院,天津 300151;2天津环湖医院)

胶质瘤多呈浸润性生长,预后较差,瘤组织内的血管密度与其恶性程度及预后呈正相关。血管抑素(AS)是近年来发现最有效的血管生成抑制剂之一,但其在血液循环中半衰期很短,很快被清除,故效果欠佳。基因转移方法能在局部持续表达抗血管生成蛋白。环磷酰胺(CTX)是临床常用的氮芥类药物。2008年 3月 ～2009年 2月,我们采用腺相关病毒为载体AS重组质粒(AAV-AS)联合CTX治疗大鼠皮下胶质瘤,效果较好。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 材料 C6脑胶质瘤细胞系;健康SD大鼠24只,体质量270～320 g,雌雄不限;AAV-AS质粒,由上海吉玛制药技术有限公司构建;CTX,细胞凋亡染色检测试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 胶质瘤细胞培养 将C6细胞常规培养于RMPI1640培养基中,于37℃、5%CO2培养箱中培养,12 d换液 1次。将处于对数生长期的细胞消化、离心后,用不含血清的RMPI 1640培养基吹打后计数,再次离心洗去血清及胰酶;加入不含血清的RMPI 1640中制成细胞悬液,调整细胞浓度为1× 107/ml。

1.2.2 大鼠胶质瘤模型的建立与分组 将C6细胞接种于24只SD大鼠右侧腹股沟皮下,7 d后肿瘤长至 250～280mm3时将大鼠随机分为 4组各 6只。对照组腹腔内注射生理盐水 0.1 ml,连续注射4 d,间隔3 d后重复,共3个疗程;CTX组腹腔内注射CTX 20mg/kg,疗程同对照组;AAV-AS组一次性腹腔内注射0.1 ml AAV-AS(3×109pfu/ml);联合组腹腔内注射AAV-AS、CTX,剂量及给药时间同前。

1.2.3 肿瘤体积观察 开始治疗后每隔3 d以电子游标卡尺测量并记录肿瘤长径(L)和短径(W),根据公式V=π/6×LW2计算肿瘤体积。

1.2.4 胶质瘤组织中微血管密度(MVD)测算 采用免疫组化染色法标记抗CD31抗体计算MVD。于治疗后第 22天处死大鼠,取肿瘤组织。每个肿瘤取最外边、中心和次外边 5个切片,每切片随机选择10个100倍视野(HP,0.24mm2)的血管平均数量。

1.2.5 肿瘤细胞凋亡检测 采用TUNEL法。肿瘤组织切片,依次经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,20 μg/m l蛋白酶K消化20 min,0.1%Triton柠檬酸钠缓冲液洗涤5 min(4℃)后,滴加50μl TUNEL混合液于切片上,37℃孵育l h,PBS漂洗后,滴加50μl Converter POD于切片上,37℃孵育30 min, PBS冲洗后,0.05%DAB显色15～20 min。于暗背景视野内,呈亮色的点为发生凋亡的细胞,进行凋亡细胞计数,计算凋亡指数(AI)。AI=凋亡细胞数/细胞总数 ×100。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。组间比较使用Bonfferoni t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肿瘤体积比较 对照组肿瘤体积为(2 060.339±82.028)mm3,CTX组为(1 763.867± 124.237)mm3,AAV-AS组为(1 229.910±141.646) mm3,联合组为(1 098.320±70.880)mm3,联合组与其他组比较,P均＜0.05。

2.2 各组肿瘤组织MVD比较 对照组MVD为(20±3)条/HP,CTX组为(18±5)条/HP,AAV-AS组为(13±2)条/HP,联合组为(8±3)条/HP,联合组与其他组比较,P均＜0.05。

2.3 各组肿瘤细胞AI比较 对照组AI为1.442 ±0.329,CTX组为1.719±0.464,AAV-AS组为3.653±0.238,联合组为 3.886±0.361,联合组与对照组及CTX组比较,P均＜0.05,但与AAV-AS组比较,P＞0.05。

3 讨论

O′Reilly等于1994年从Lewis肺癌大鼠的血清和尿液中分离出相对分子质量为38 kD的蛋白,即为AS。研究表明,AS能特异性地抑制内皮细胞的增殖,而对其他类型的细胞如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等的增殖无影响[1]。因此,利用血管生成抑制剂特异性地抑制血管内皮细胞的增殖,理论上可抑制肿瘤的生长和转移而不影响其他宿主细胞[2]。但 AS半衰期很短,在血液循环中很快就被清除,因此如果要维持病灶局部的浓度以达到治疗效果,就需要长时间持续用药,治疗费用非常昂贵。

将病毒作为基因治疗载体首先需要考虑的是其安全性,特别是需要大量的病毒作为治疗性基因传递的载体。AAV具有其他病毒载体所没有的优势,即野生型AAV不会产生任何人类疾病。将AAV用于基因治疗实验至今,尚未发现AAV载体引起的组织炎症及其他细胞免疫反应[3];并且AAV的DNA微阵列研究表明,AAV的基因表达对细胞突变的作用非常小[4]。研究表明,转导 AAV后,肌内、支气管内、肝动脉和视网膜下可检测到较低水平和暂时存在的AAV;分析患者体液也显示,AAV在尿、唾液和血清中可以短期存在。其在体内被宿主细胞免疫清除时间不超过 6周[5]。基因治疗是将外源基因通过基因转移方式导入患者体内,表达相关蛋白并发挥相关功能,最终达到直接或间接治疗肿瘤的目的[6]。但现阶段血管抑制基因治疗也存在不足之处,因其作用机理不是直接杀死肿瘤细胞,而是通过抑制血管的生成而使肿瘤因缺乏养分停止生长,大部分肿瘤细胞发生凋亡、坏死,但有部分瘤细胞进入休眠状态。这些休眠的肿瘤细胞在血管促进生长因子的作用下,可以重新复苏[7]。所以,血管抑制疗法需联合其他方法,才有希望治愈肿瘤。本研究显示,单纯应用AAV-AS治疗可明显抑制肿瘤体积生长,使新生血管密度降低,病灶内凋亡细胞增多,证实AAV-AS可以通过抗血管生成途径达到抑制胶质瘤生长的作用。

CTX是临床常用的氮芥类药物,其抗血管生成作用表现为双阶段性,在低剂量阶段表现为对内皮细胞的特异性抑制作用,在高剂量阶段表现为非选择性的细胞毒作用[8]。本研究采取低剂量、高频率给药方法,从而避免了大剂量给药产生的细胞毒性作用对实验结果的干扰。本研究发现,CTX可抑制肿瘤体积生长、减低血管密度,但对肿瘤细胞凋亡无影响,其原因可能与我们采用低剂量CTX化疗有关。其作用机制为抗血管生成途径抑制肿瘤的生长,从而间接促进肿瘤细胞的凋亡,而非直接杀灭肿瘤细胞。

本研究也显示,联合组与其他三组相比,对肿瘤体积及血管内皮生长的抑制具有显著性,但联合治疗与单独应用基因治疗对肿瘤细胞AI的影响在本研究中未体现出显著差异,其原因可能是联合治疗低剂量CTX表现为抗血管生成作用,而非直接杀灭肿瘤细胞的结果。CTX作用机制为促进血管内皮细胞凋亡,而AAV-AS则是特异性的抑制血管内皮细胞的增殖,在抗血管内皮生长方面两者具有协同作用。两种方法联合使用既填补了单独应用化疗药物所产生的间歇期空白,减轻化疗的不良反应,同时又能够弥补基因治疗的不稳定性及局限性。在此条件下,可使原发灶维持在休眠状态,抑制转移灶的形成和扩展,从而延缓病情发展,争取再次手术机会。

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