长期投喂黄芪多糖对黄颡鱼抗氧化及非特异性免疫指标的影响

白东清 吴 旋 郭永军 朱国霞 邢克智 宁 博

(天津农学院水产科学系，天津市水产生态及养殖重点实验室，国家级实践教学示范中心，天津 300384)

长期投喂黄芪多糖对黄颡鱼抗氧化及非特异性免疫指标的影响

白东清 吴 旋 郭永军 朱国霞 邢克智*宁 博

(天津农学院水产科学系，天津市水产生态及养殖重点实验室，国家级实践教学示范中心，天津 300384)

本文旨在探讨添加不同水平的黄芪多糖(astraglus polysaccharides，APS)对黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)抗氧化及非特异性免疫指标的影响。选取2龄健康黄颡鱼540尾，随机分成6组，每组3个重复，每个重复30尾鱼，分别投喂在基础饲料中添加0(对照组)、300、600、900、1 200、1 500 mg/kg黄芪多糖的试验饲料，试验期为8周。于试验结束后测定黄颡鱼体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)与溶菌酶(LSZ)活力，丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量，吞噬细胞的吞噬百分比(PP)、吞噬指数(PI)以及疾病抗性等指标。结果表明:与对照组相比，300 mg/kg组头肾中以及600、900 mg/kg组肌肉中SOD活力分别提高1.61、1.95与2.08倍，差异显著(P＜0.05);600～1 500 mg/kg黄芪多糖能显著提高黄颡鱼心脏、肝脏、脾脏、肌肉与鳃中的CAT活力(P＜0.05)，且各添加组的头肾与中肾中CAT活力均显著升高(P＜0.05);300～1 500 mg/kg组肝脏与脾脏中，600～1 500 mg/kg组心脏、头肾、中肾、肌肉与鳃中的MDA含量与对照组相比显著降低(P＜0.05)。各添加组的心脏、肝脏、脾脏与头肾中以及600～1 500 mg/kg组的头肾与中肾中 NO含量均显著低于对照组(P＜0.05)。在0～1 200 mg/kg范围内黄芪多糖添加水平与LSZ活力成正比，所有组织内LSZ活力较对照组均有显著性地提高(P＜0.05)。随黄芪多糖添加水平的升高，吞噬百分比与吞噬指数显著升高(P＜0.05)。黄芪多糖可降低迟钝爱德华氏菌攻毒后鱼的死亡率，提高免疫保护率，尤其是1 200、1 500 mg/kg组，免疫保护率均达到50.0%。由此得出，在饲料中添加适宜水平的黄芪多糖可促进黄颡鱼抗氧化功能的提升;饲料中添加黄芪多糖可促进黄颡鱼非特异性免疫功能的提高，且以1 200 mg/kg添加水平的效果最佳。

黄颡鱼;黄芪多糖;抗氧化指标;非特异性免疫指标

为适应人们生活水平的不断提高，水产养殖规模呈现逐年扩大的态势，但随之而来却是养殖动物疾病的大规模爆发。中草药及其提取物已经成为了代替抗生素，治疗、预防水产动物疾病的首选药物。黄芪作为一种多年生草本补益类中药，具有味甘、性温，具有补气升阳、固表止汗、托毒排脓和生肌等功效［1］。黄芪多糖(astraglus polysaccharides，APS)是从黄芪中提取的天然活性成分，具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、调节机体体液免疫、激活免疫细胞因子等功效［2］。目前，黄芪多糖以其显著的免疫增强、抗病毒作用，加之价格低廉、来源丰富、毒性低、无耐药性等［3］特性广泛的应用于临床医疗、畜牧及水产动物的养殖中。黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)是一种小型的淡水经济鱼类，具有较高的营养及经济价值，但近年来各种疾病的爆发成为了制约黄颡鱼养殖业高速发展的主要因素。因此，本研究通过在饲料中添加不同水平的黄芪多糖，探讨长期投喂黄芪多糖对黄颡鱼抗氧化及非特异性免疫指标的影响，为黄芪多糖在水产养殖业中的长期应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

自天津农学院养殖渔场选取2龄健康黄颡鱼540尾，平均体重(61.6 ±5.4)g，平均体长(19.5±3.2)cm，随机分为 6组，每组 3个重复，每个重复30尾鱼(雌雄各占1/2)。6组试验鱼分别饲喂在基础饲料中添加0(对照组)、300、600、900、1 200、1 500 mg/kg 黄芪多糖(购于陕西方晟生物科技公司，有效含量＞90%)的试验饲料。

试验鱼以重复为单位饲养于架设在养殖池中的规格为1.5 m ×1.5 m ×1.0 m 的18个网箱中。试验期间水温保持在(26±2)℃，每天连续充氧，试验期间每天换水1/3左右，日投饲率为2%，每日投喂3次，试验期为8周。

1.2 样品制备与指标测定

1.2.1 抗凝血及粗酶液的制备

于养殖试验结束后，每组随机抽取黄颡鱼30尾(雌雄各占1/2)，使用MS－222对试验鱼实行麻醉。擦拭体表后，使用5 m L一次性无菌注射器进行尾静脉取血，抽血前使用的一次性无菌注射器及离心管预先用1%的肝素钠进行湿润。

抽血后的黄颡鱼在冰浴条件下进行解剖，剥取心脏、肝胰脏、脾脏、头肾、中肾、肌肉与鳃组织，各组织再按质量体积比1∶9加入预冷生理盐水，用YQ－3型电动匀浆机在冰浴条件下进行组织匀浆。用Eppendorf冷冻离心机在4℃，3 000 r/m in离心20 m in，提取上清液即为粗酶液。

1.2.2 抗氧化指标的测定

试验中各组织超氧化物歧化酶(SOD)、氧化氢酶(CAT)活力及丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)及蛋白质含量等指标采用南京建成生物工程技术研究所提供的试剂盒进行测定。

1.2.3 非特异性免疫指标的测定

1.2.3.1 溶菌酶(LSZ)活力的测定

试验所用溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)由天津科技大学生物工程学院提供。溶壁微球菌接种于琼脂培养基上，在37℃条件下培养24 h后，用PBS缓冲液稀释至波长570 nm下吸光度为0.3的菌悬液备用。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

取200μL菌悬液与20μL粗酶液在96孔板中混匀，并在酶标仪上使用570 nm的波长测定初始光密度值A0，然后置于27℃下水浴30 m in，取出后立即置于冰浴中终止反应，并在570 nm波长下测定反应后的光密度值A，LSZ活力=(A0－A)/A。

1.2.3.2 吞噬细胞活力的测定

试验所用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由天津农学院水产生态及养殖重点实验室提供，使用法国生物梅里埃公司生产的VITEK2－Compact全自动微生物鉴定仪鉴定细菌纯度。将细菌接种于琼脂培养基斜面上，37℃条件下传代2次，用无菌PBS洗下菌落。离心后加入1%福尔马林灭活24 h，将菌液调整为1.0×108cell/m L备用。

取100μL抗凝血，加入100μL的金黄色葡萄球菌液，摇匀，在27℃条件下孵育30 m in，孵育期间每隔10 m in摇晃1次。用吸管吸取混合液涂片，用甲醇固定10 m in，Giemsa染色1 h，水洗晾干后镜检。吞噬细胞活力分别以吞噬百分比(phagocytic percentage，PP)和吞噬指数(phagocytic index，PI)表示:

1.2.3.3 疾病抗性检测

试验用迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)由天津市病害防治中心提供。于饲喂试验结束后采用迟钝爱德华氏菌(2.0×108cell/m L)对各组试验鱼进行攻毒。每组分别取试验鱼20尾(雌雄各占1/2)，经胸鳍基部注射0.2 m L迟钝爱德华氏菌悬液。饲养观察96 h后，统计各组的死亡率，依下式计算死亡率(mortality rate，MR)与免疫保护率(protective rate，PR)。

1.3 数据处理

试验数据用平均值±标准误表示，数据分析采用 SPSS 17.0软件包中的单因素方差分析(One-way ANOVA)处理，以P＜0.05作为差异显著性标准。

2 结果

2.1 黄芪多糖对黄颡鱼各组织中SOD活力的影响

黄颡鱼体内各组织中SOD活力顺序为心脏＞肌肉＞鳃＞肝脏＞头肾＞中肾＞脾脏(表2)。添加黄芪多糖对心脏、肝脏、脾脏和鳃中SOD活力影响不大(P＞0.05)。与对照组相比，300 mg/kg组头肾中以及600、900 mg/kg组肌肉中SOD活力分别提高 1.61、1.95与 2.08倍，差异显著(P＜0.05)。

表2 黄芪多糖对黄颡鱼各组织中SOD活力的影响Table 2 Effect of APS on the SOD activity in tissues of yellow catfish U/mg prot

2.2 黄芪多糖对黄颡鱼各组织中CAT活力的影响

黄颡鱼体内各组织中CAT活性顺序为心脏＞肌肉 ＞肝脏 ＞鳃 ＞头肾 ＞中肾 ＞脾脏(表3)。与对照组相比，600～1 500 mg/kg黄芪多糖能显著提高黄颡鱼心脏、肝脏、脾脏、肌肉与鳃中的CAT活力(P＜0.05)，且各添加组的头肾与中肾中CAT活力均显著升高(P＜0.05)。

表3 黄芪多糖对黄颡鱼各组织中CAT活力的影响Table 3 Effect of APS on the CAT activity in tissues of yellow catfish U/mg prot

2.3 黄芪多糖对黄颡鱼各组织中MDA含量的影响

黄颡鱼体内各组织中MDA含量顺序为肌肉＜肝脏 ＜鳃 ＜中肾 ＜头肾 ＜心脏 ＜脾脏(表4)。与对照组相比，300～1 500 mg/kg组肝脏与脾脏中，600～1 500 mg/kg组心脏、头肾、中肾、肌肉与鳃中的MDA含量显著降低(P＜0.05)。

表4 黄芪多糖对黄颡鱼各组织中MDA含量的影响Table 4 Effect of APS on the MDA content in tissues of yellow catfish nmol/mg prot

2.4 黄芪多糖对黄颡鱼各组织中 NO含量的影响

黄颡鱼体内各组织中NO含量顺序为肌肉＞心脏＞肝脏＞鳃＞头肾＞中肾＞脾脏(表5)。添加黄芪多糖后，各组织中NO含量均低于对照组，且随着黄芪多糖水平的增加而降低(除1 500 mg/kg组心脏、头肾中NO含量略有上升)。其中，各添加组的心脏、肝脏、脾脏与头肾中以及600～1 500 mg/kg组的头肾与中肾中NO含量均显著低于对照组(P＜0.05)。

表5 黄芪多糖对黄颡鱼各组织中NO含量的影响Table 5 Effect of APS on the NO content in tissues of yellow catfish nmol/mg prot

2.5 黄芪多糖对黄颡鱼体内组织LSZ活力的影响

黄颡鱼体内各组织中LSZ活力顺序为头肾＞中肾＞心脏＞脾脏＞鳃＞肌肉＞肝脏(表6)。各添加组各组织中LSZ活力均高于对照组，且在0～1 200 mg/kg范围内黄芪多糖添加水平与酶活力成正比，所有组织内LSZ活力较对照组均有显著性的提高(P＜0.05)。

表6 黄芪多糖对黄颡鱼各组织中LSZ活力的影响Table 6 Effect of APS on the LSZ activity in tissues of yellow catfish U/mg prot

2.6 黄芪多糖对黄颡鱼吞噬细胞活力的影响

投喂含不同水平的黄芪多糖饲料8周后，检测黄颡鱼体内吞噬细胞活力发现，各添加组的吞噬百分比与吞噬指数均显著高于对照组(P＜0.05)，且随黄芪多糖添加水平的升高呈增加趋势，除1 200、1 500 mg/kg组间吞噬百分比无显著差别外(P＞0.05)，其余各组间的吞噬百分比与吞噬指数随黄芪多糖水平增加而显著上升(P＜0.05)(表7)。

表7 黄芪多糖对黄颡鱼吞噬细胞活力的影响Table 7 Effect of APS on the phagocytic activity of yellow catfish %

2.7 攻毒试验结果

黄颡鱼养殖8周后，经迟钝爱德华氏菌活菌攻毒96 h，对照组死亡率为80%，各添加组的死亡率均有所降低，获得了一定的免疫保护率，尤其是1 200、1 500 mg/kg组，免疫保护率均达到50.0%。此外，试验中黄颡鱼的死亡率与免疫保护率与黄芪多糖添加水平存在一定的剂量关系(表8)。

表8 黄芪多糖对黄颡鱼疾病抗性的影响Table 8 Effect of APS on disease resistance of yellow catfish

3 讨论

3.1 黄芪多糖对黄颡鱼抗氧化指标的影响

NO是近年来研究较多的一种免疫与调控因子，其在生物体内具有双向调节作用的理论已经被许多研究相继证实［4－5］;SOD与CAT是生物体抗氧化酶系的重要组成酶类，对生物体内活性氧自由基地清除起着关键的作用;MDA则是脂质过氧化物反应中的最终产物，可导致机体细胞的损伤。检测这些指标可以综合地判定生物机体的抗氧化与免疫情况。近年来的诸多研究报道均表明，黄芪多糖在促进鱼体抗氧化功能提升方面具有明显的效果。张伟妮等［6］研究发现，在罗非鱼(Tilapia)饲料中添加不同剂量的黄芪多糖，可提高鱼体SOD与CAT活力，且添加水平在1 000～2 000 mg/kg时提高作用显著;富丽静等［7］研究表明，在饲料中添加0.165、0.660 g/kg的黄芪多糖可显著地提高草鱼(Ctenopharyngodon idellus)体内SOD活力;吴旋等［8］试验得出，使用黄芪多糖浸泡金丝鱼(Tanichthrs altbonubes)可以显著地提高鱼体内SOD与CAT活力;刘红柏等［9］试验证实，对史氏鲟(Acipenser schrenckiBrandt)灌服不同浓度的黄芪多糖水煎剂，其肝脏与血清中SOD活力较对照组均有所提高，且各浓度组MDA含量显著降低。这充分说明适宜添加水平黄芪多糖可以有效提高鱼体的抗氧化能力。

以上学者的研究结论均可作为本试验的理论支撑。本试验的结果显示，黄芪多糖添加在饲料中投喂黄颡鱼，鱼体各组织中SOD与CAT活力均提高，且在心脏与鳃等氧交换密切的组织中SOD与CAT活力明显地高于脾脏、肾脏等组织。同时，与对照组相比，各添加组肝脏与脾脏中MDA含量也得到了显著地降低。在以前的研究中，鲜有关于鱼类肌肉抗氧化酶活力的报道，大多数的研究仅是测定鱼体血清、肝脏等少数组织的抗氧化酶活力。而在研究中发现，黄颡鱼的肌肉组织抗氧化功能较强，且投喂黄芪多糖后效果更佳显著。因此，本研究很好的证实了有些鱼类的肌肉具有较高的抗氧化功效这一理论，在今后的生产实践中具有良好地开发前景及应用空间。

关于中草药多糖对水产动物机体NO的调节机制，科研工作者也进行了相应的研究:黄江［10］通过试验得到，灌服含黄芪、当归等成分的复方中草药水煎液的史氏鲟血液中NO的含量显著降低，黄芪、鱼腥草、甘草复方则可显著降低史氏鲟肝脏内NO的含量，而单方贯众、复方四却对史氏鲟血液中NO含量具有明显的促进作用;苏岭等［11］研究发现，复方甘草与紫草对鲫鱼(Carassius aumtus)脾脏内NO含量具有抑制作用，但对肝脏中NO含量却具有促进作用;同时，黄芪多糖对脾脏中NO的含量也具有促进作用。在本试验中，黄颡鱼肌肉NO含量明显高于其他组织，但各组织NO含量随着黄芪多糖添加水平的增加而下降。而此结论却与有关黄芪多糖在适宜的添加范围内可促进动物体内NO含量提升的研究结论［6］不尽相同。因此，综合以上的研究结果得出，黄芪多糖对生物体内NO含量的影响与中草药、中草药多糖的种类、剂量、给药时间、生物机体自身等多种因素有关，在生产实践中对上述因素应进行仔细考量。

3.2 黄芪多糖对黄颡鱼非特异性免疫指标的影响

非特异性免疫能力有LSZ活力、吞噬细胞活性、疾病抗性等多种反应组成，是鱼类抵抗病原入侵，维护机体健康的重要特性。近年来，许多学者就黄芪多糖对水产动物非特异性免疫功能的调节作用进行了大量的研究。胡兵等［12］研究发现，添加黄芪多糖能提高异育银鲫(Carassiusauratus gibelio)体内LSZ活力，且0.05%的添加水平效果最佳;Yin等［13］使用含0.5%黄芪水提物的饲料对鲤鱼(Cyprinus carpio)进行投喂，结果发现鱼体血液中LSZ活力、吞噬细胞的吞噬活力、疾病抗性与对照组相比均有大幅的提升;孙永新［14］发现，饲料中添加黄芪多糖可有效提高刺参(Apostichopus jaoponicus)体内LSZ活力、吞噬指数与吞噬率，攻毒后试验组的发病率有所降低;László等［15］用含有黄芪水提物的饲料投喂罗非鱼，结果表明鱼体LSZ活力显著高于对照，攻毒后的存活率也有所提高。

以上结论与本试验得出黄芪多糖可以有效提高黄颡鱼体内LSZ活力，且以鱼类最主要的免疫器官头肾中的酶活力最强，对黄颡鱼的吞噬细胞活性及疾病抗性的提高也有显著的功效，并且存在规律的量效关系的结论相一致，进一步证明了黄芪多糖在促进黄颡鱼非特异性免疫功能方面的良好效果。

4 结论

①本试验中，长期连续投喂适宜水平的黄芪多糖能有效地促进黄颡鱼体内SOD、CAT活力，降低MDA含量，但对黄颡鱼体内NO含量却具有抑制作用。

②不同添加水平的黄芪多糖对各项抗氧化指标的作用效果存在差异，对 SOD、CAT、MDA及NO指标的最适添加水平分别为600、1 200、1 500和300 mg/kg。

③不同添加水平的黄芪多糖可有效地提高黄颡鱼体内LSZ活力、吞噬细胞活性与疾病抗性，且作用功效较为规律，综合各项指标判定1 200 mg/kg的添加水平对黄颡鱼非特异性免疫功能的促进作用最佳。

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*Corresponding author，professor，E-mail:kzxing@yahoo.com.cn

(编辑 菅景颖)

Effect of Astragalus Polysaccharides on Antioxidant and Nonspecific Imm une Indices of Yellow Catfish(Pelteobagrus fulvidraco)over Long-term Feeding

BAIDongqing WU Xuan GUO Yongjun ZHU Guoxia XING Kezhi*NING Bo
(Tianjin Key Laboratory of AQU-ecology and Aquaculture，National Demonstration Center of Teaching Practice，Tianjin Agricultural University，Tianjin300384，China)

This experimentwas conducted to investigate the effect of astragalus polysaccharides(APS)on antioxidant and nonspecific immune indices of yellow catfish(Pelteobagrus fulvidraco).Five hundred and forty 2-year-old and healthy yellow catfish were random ly divided into 6 groups with 3 replicates per group and 30 fish per replicate.Yellow catfish in the 6 groupswere fed basal dietswith 0(control group)，300，600，900，1 200 and 1 500 mg/kg APS，respectively.The experiment lasted for 8 weeks.A t the end of the experiment，the activities of superoxide dismutase(SOD)，catalase(CAT)and lysozyme(LSZ)，the contents ofmalondialdehyde(MDA)and nitric oxide(NO)，phagocytic percentage(PP)，phagocytic index(PI)，and disease resistance indiceswere determ ined.The results showed as follows:compared with the control group，the head kidney SOD activity in the 300 mg/kg APS group and themuscle SOD activity in the 600 and 900 mg/kg APS groupswere increased by 1.61(P＜0.05)，1.95(P＜0.05)and 2.08(P＜ 0.05)times，respectively.The CAT activity in heart，liver，spleen，muscle and gill was significantly enhanced when supplemented with 600 to 1 500 mg/kg APS in diets(P＜0.05).The CAT activity in head kidney and mesonephros in all APS groupswas significantly higher than that in the control group(P＜0.05).Compared with the control group，the MDA activity in liver and spleen in the 300 to 1 500 mg/kg APS groups and the MDA activity in heart，head kidney，mesonephros，muscle and gill in the 600 to 1 500 mg/kg APS groupswere significantly increased(P＜0.05)，while the NO content in heart，liver，spleen and head kidney in all groups and the NO content in head kidney and mesonephros in the 600 to 1 500 APS groupswere significantly decreased(P＜0.05).When supplemental levels of APS ranged from 0 to 1 200 mg/kg，the LSZ activity was proportional to APS supplemental level，and the LSZ activity in all tissues was significantly higher than that in the control group(P＜0.05).With increasing APS levels，the PP and PIwere significantly increased(P＜ 0.05).APS could decrease themortality rate and enhance the protective rate when fish were over attacked withEdwardsiella tard，and the protective rate in the 1 200 and 1 500 mg/kg APS groups reached 50.0%，respectively.It is suggested that proper amount of APS supplementation in diets can enhance antioxidant of yellow catfish;additionally，1 200 mg/kg APS supplementation has the greatest effects on enhancing nonspecific immunity function of yellow catfish.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1622-1630］

yellow catfish(Pelteobagrus fulvidraco);astragalus polysaccharides;antioxidant indices;nonspecific immune indices

S963

A

1006-267X(2011)09-1622-09

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.023

2011－03－23

天津市高等学校科技发展基金计划(2008ZD21和2006ZD24);天津市农业科技成果转化与推广项目(201004040)

白东清(1970—)，女，河北迁安人，教授，博士，硕士生导师，主要从事水产动物营养与饲料学的教学和研究工作。E-mail:baidongqing@tjau.edu.cn

*通讯作者:邢克智，教授，硕士生导师，E-mail:kzxing@yahoo.com.cn