抗草丁膦转基因玉米不同DNA提取方法及PCR检测

杨慧珍，车 丽，任志强，肖建红

（1.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030032；2.山西省农业科学院现代农业研究中心，山西太原030031）

杂草为害是造成玉米（Zeamays L.）减产的重要因素之一。植物基因工程技术的诞生和发展，为玉米抗除草剂育种提供了一条有效的途径[1]。

李敬娜等[2]以pCambia3301载体为基础，以玉米Ubiquitin（Ubi）启动子、拟南芥叶绿素转运肽（Chloroplast transit peptide，Ctp）基因、抗草甘膦Epsps基因为元件，构建了玉米高效双元表达载体，通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404，并通过农杆菌介导法转化玉米幼胚，获得了抗草甘膦无抗生素标记的转基因玉米植株。马云霞等[3]采用根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将抗草甘膦基因（sxglr-11）导入优良玉米再生系HiII，获得抗除草剂转基因植株。关于抗草丁膦转基因玉米的研究，Sawahel[4]用电击法将bar基因导入了玉米幼胚中，获得了抗除草剂玉米材料。李国圣等[5]利用基因枪法将als基因导入了玉米愈伤组织中，获得了转基因玉米。朱常香等[6]利用基因枪法将bar基因导入了玉米自交系的幼胚中，获得了抗除草剂转基因玉米自交系。bar基因转化水稻等[7]也获得了抗除草剂转基因植株。bar基因（bialaphos resistance gene）编码膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase，PAT），而PAT蛋白能使除草剂草丁膦（glufosinate）脱毒，从而使转bar基因的作物具有抗除草剂的性状[8]。

用PCR方法检测转基因玉米已有不少报道，包括常规PCR检测[9]、定性PCR检测[10]、多重PCR检测[11]和实时定量PCR检测[12]等。

本研究通过不同植物总DNA的提取方法，对转基因材料PCR分析时设置内源标准基因，探讨和分析其PCR扩增产物的大小及序列准确性，建立一个快速、有效的转基因玉米及其产品的检测方法，旨在为有关研究提供一定的理论及技术依据。

1 材料和方法

1.1 材料

植物材料为花粉介导法导入bar基因（启动子为CaMV35S启动子）到玉米自交系黑玉2号所获得的转基因种子，它来自山西省农业科学院生物技术研究中心；非转基因对照玉米自交系黑玉2号种子由山西省农业科学院品种资源研究所提供。

1.2 引物的设计与合成

CaMV35S启动子引物序列、玉米内标准基因Zein引物序列和外源基因bar基因引物序列如表1所示。所用引物均由上海生工生物工程公司合成，用TE稀释为100mmol/L。

表1 引物序列及扩增片断长度

1.3 总DNA提取

将玉米种子研磨成细粉，装入2mL离心管中，用改良 PEX法、CTAB法[13]和 SDS法[14]分别提取总DNA。

改良PEX提取方法为：每管分别加入PEX提取液 （PEX 12.5mmol/L；Tris-Cl 100mmol/L；NaCl700mmol/L；EDTA 10mmol/L（pH 值 8.0）；PVP 6%）500μL，于65℃水浴中保温20min；然后分别加入400μL Tris饱和酚，400μL氯仿/异戊醇（24∶1，V/V），轻轻颠倒混匀，冰浴放置5min，11 000 r/min离心10min；取上清液至另一2mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀，冰浴放置5min，11 000 r/min离心10min；再取上清液至新的2mL离心管中，加入1/10体积的5mol/L乙酸钠，混匀数分钟后，加入9/10体积的冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min，然后13 000 r/min离心12min；弃上清，加入200μL 70%乙醇，颠倒数次漂洗沉淀，13 000 r/min离心1min。同样方法再用70%乙醇漂洗1次；待乙醇蒸发完后，加入40μL TE缓冲液，溶解DNA。

于0.8%琼脂糖凝胶电泳观察提取DNA的效果，用核酸蛋白检测仪测定DNA浓度，并用1×TE将总DNA稀释至100 ng/μL备用。

阳性对照DNA按照分子克隆实验指南[15]进行。

1.4 PCR扩增

建立PCR扩增体系：体积20μL，10×缓冲液（含 Mg2+）2.0 μL，dNTPs（2.5mmol/L）1.6 μL，模板DNA 2.0μL，引物各0.8μL，Taq酶（5U/μL）0.4μL，用无菌去离子水定容至20μL。反应在PT-100型PCR仪上进行。试验设阴性对照和空白对照。

扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。不同引物的退火温度分别为：CaMV35S启动子55℃，Zein基因55℃，bar基因55℃。反应结束后取PCR扩增产物8μL，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测（含溴化乙锭），用DL 2 000 DNA Marker为参照判断扩增产物的大小，用SYN凝胶成像系统照相。当PCR扩增产物大小与预期结果一致时，用生工公司生产的回收试剂盒回收DNA，并送生工公司测序。

2 结果与分析

2.1 提取DNA的纯度和浓度

首先用SDS，CTAB和改良PEX 3种方法分别提取3份DNA样品，所提取的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，SYN成像系统观察（图1），发现这3种方法所提取DNA在凝胶上形成一条整齐的条带，除CTAB法提取的DNA在前方有少量RNA污染物出现外，其他2种方法提取的DNA质量都较高。

经核酸蛋白检测仪测定，这3份DNA的质量浓度达到 600～800μg/mL，OD260/OD280值在2.0左右，OD260/OD230值在1.6～1.8之间，均达到对DNA进行分析的要求（表2）。但综合这3种植物DNA提取方法，按一个流程计，PEX方法比SDS方法节省0.45 h，比CTAB方法节省2.0 h。

表2 提取DNA在核酸蛋白检测仪上的测定结果

本着检测方法快速、准确的特点，本研究选用PEX法提取其余植物材料DNA，并做进一步的PCR分析。

2.2 抗草丁膦转基因玉米PCR检测方法建立

用CaMV35S和bar引物进行PCR扩增的结果如图2所示。不含模板DNA的空白对照无扩增产物出现，说明PCR操作过程无污染。用Zein引物从转基因和非转基因黑玉2号均扩增出151 bp的产物，这与玉米中Zein片段的大小一致，说明从非转基因对照玉米和转基因玉米中所提取的DNA能有效地进行PCR扩增。用CaMV35S和bar引物扩增时，产物与预期大小（195，552 bp）相似，说明用这2对引物能从转基因玉米中扩增出目标片段。

为了验证扩增片段是否为目的基因，将用CaMV35S启动子和bar基因引物从转基因植物中扩增的片段分别回收测序，将测序结果用Blast进行同源性分析。从扩增片段与全长bar基因极高的相似性可以看出，扩增片段为CaMV35S启动子和bar基因，用这2对引物从转基因植物中扩增出了目标基因，因此，可以用这2对引物鉴定抗草丁膦转基因玉米。

3 讨论

关于植物基因工程，转化方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、非组培法[16]等，所获得转基因植物及其产品的快速检测也有不少报道，主要是建立适合PCR分析的植物总DNA的快速提取方法[17]。

本研究采用3种方法分别提取植物总DNA，其中，改良PEX法每个流程比SDS法节省0.45 h，比CTAB法节省2.0 h，而且提取的DNA的浓度、纯度测定结果显示均可满足PCR检测分析及其他分子检测的要求，且PCR检测结果也符合预期目的。改良PEX提取DNA结合PCR检测，无疑是一种快速、有效的转基因玉米及其产品的检测方法。

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