实时荧光定量PCR检测应力性骨折新兵外周血TNFRSF10C mRNA表达

王毅铮 赵化冰 兰晓霞 张明顺 高宏生 张国辉 赵国平，4 尹光雅，4 王世鑫

1 武警医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室（天津 300162） 2 武警医学院部队卫生学教研室 3 武警医学院流行病学教研室 4 河北医科大学公共卫生学院 5 天津市东丽区东丽医院

应力性骨折（stress fracture，SF）亦称疲劳性骨折（fatigue fracture），是体育运动和军事训练中常见的损伤。SF的病理特点为骨损伤与修复同时进行，SF发生后如得不到充分休息，骨折部位可能出现骨折－修复－再骨折－再修复的反复过程，导致骨折延迟愈合、不愈合，甚至局部骨坏死［1］。因此，早期诊断是防治SF的关键。现有SF诊断方法多为临床现场诊断与影像诊断相结合，主观因素较大，常造成误诊；而SF诊断的金标准核骨扫描造价昂贵，使用有局限性。我们前期研究［2］采用人表达谱芯片技术，获得SF患者外周血白细胞基因表达谱变化的研究数据。本研究旨在验证前期芯片结果可信性，并进一步观察TNFRSF10C基因差异表达与SF之间的关系，为分析SF病理机制提供mRNA水平的证据，同时也为初步探索TNFRSF10C基因作为SF早期诊断生物标志物的可行性积累实验基础。

1 对象和方法

1.1 研究对象

实验标本取自驻津武警某部2008年度入伍新兵（均为男性）。采用1:1配比的病例对照研究，正常对照组10例，应力性骨折组10例。病例对照配比标准为：与病例处于相同连队（训练量和科目相同），身体条件（BMI指数）相似，但未发生SF的战士。SF诊断标准为［3］：①伤史采集：主诉四肢某部位无明显原因的较为固定的疼痛，且疼痛随训练强度加大而加重，休息后自觉减轻；②专科检诊：沿骨干长轴触诊有局部固定压痛点或纵向叩击痛，可伴不同程度软组织肿胀；③特殊检查：常规X线检查证实有骨膜反应、骨裂或骨折者。凡具上述①、②或①、③均可诊断为SF。

1.2 主要试剂和仪器

外周血RNA提取试剂盒TRIpure LS Reagent购自北京BioTeke公司；cDNA合成试剂盒、实时荧光定量试剂盒和DL2000 plus DNA marker均购自北京TransGen Biotech公司；EX Taq和引物均购自宝生物工程（大连）有限公司；StepOne型实时荧光定量PCR仪购自美国AB公司；ChemiDoc XRS凝胶成像系统购自美国Bio-rad公司。

1.3 总RNA抽提与cDNA合成

取每位SF战士及其1:1配比正常对照战士的空腹肘静脉血5ml，肝素抗凝。外周血总RNA提取按TRIpure LS Reagent试剂盒操作指南进行，2h之内完成。在260 nm/280 nm波长下测定总RNA浓度和纯度。取至少1µg外周血总RNA参照试剂盒说明逆转录成cDNA。逆转录反应体系如下：样 品 RNA 1µg、Random Primer（N9）（0.1µg/μl）1µl、2×ES Reaction Mix 10µl、EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1µl，补充DEPC处理过的水至体积20µl。上述成分混匀后置于PCR仪中，25℃孵育10 min，42℃孵育50 min，70℃15 min灭活。

1.4 引物设计

为了保证本实验TNFRSF10C引物的特异性，根据已发表的TNFRSF10C mRNA序列（Genebank序列号 gi：22547120），先将 TNFRSF10C mRNA与其家族内其他同源性较高的成员进行Blast比较，选定有较高特异性的区段作为靶序列进行引物设计。将TNFRSF10C mRNA的靶序列输入Primer Premier 5.0软件，综合考虑引物长度、GC含量、Tm值、自由能、引物二聚体等因素，获得一组评价较高的引物。该组引物分别与TNFRSF10C mRNA序列1140bp-1160bp以及1330bp-1350bp区段互补结合，两个引物长度均为21bp，GC含量均为52.38%，退火温度分别为51.41℃和51.92℃。TNFRSF10C上游引物 ：5’CTGGCTCTATCTTCCTCCTTG 3’， 下 游 引物 ：5’CTTCTCATCCTCACCCTTGTC 3’， 扩 增 片段长度为211bp。内参基因为3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyseraldenhyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因，上游引物：5’AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 3’，下游引物：5’AGGGGCCATCCACAGTCTTC 3’，扩增片段长度为258bp。GAPDH引物引自网上公布的通用引物（www.shinegene.org.cn）。

1.5 实时荧光定量PCR

20μl反 应 体 系 ：SYBRR®Premix Ex TaqTM（2×）10µl；PCR Forward Primer（10µM）1µl；PCR Reverse Primer（10µM）1µl；模板 cDNA 2µl；以去离子水补足20µl。TNFRSF10C基因反应条件：95℃预变性 10min，94℃ 50 s，50℃ 30 s，72℃25 s，40个循环。GAPDH扩增条件退火温度为56℃，其他与TNFRSF10C相同。为了避免引物二聚体干扰荧光信号，检验扩增目的片段的特异性，在每个循环内加入读板步骤，于82 ℃采集荧光信号，总延伸结束后，加入溶解曲线的制备（65～95℃，每0.2 ℃读板一次）步骤。每个标本均平行扩增3管。

1.6 计算基因相对表达量

采用最优反应条件，完成10例SF病例及其对照样本TNFRSF10C基因表达检测。采用2－△△Ct法对TNFRSF10C基因表达量进行相对定量分析，GAPDH为管家基因。计算公式如下：△Ct（SF组）=SF组目的基因平均Ct值- SF组管家基因平均Ct值；△Ct（对照组）=对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值；△△Ct = △Ct（SF组）- △ Ct（对照组）；比率（SF组/对照组）= 2-△△Ct。

2 结果

2.1 引物设计

经Blast同源性检索，所设计的目的基因引物只特异性结合人TNFRSF10C mRNA，未发现与人肿瘤坏死因子（TNF）超家族其他成员mRNA错配的报告。

2.2 RNA提取和逆转录结果

成功提取10例SF及其对照外周血RNA，260/280比值在1.5～1.9之间。逆转录成cDNA后，扩增每个样本的GAPDH管家基因，2%琼脂糖凝胶电泳结果显示（图1），各样本均可扩增出258 bp清晰条带，各组样本逆转录cDNA均符合实验要求。

2.3 实时荧光定量PCR条件及特异性结果

TNFRSF10C基因及内参基因GAPDH扩增效果及特异性见图2。TNFRSF10C基因PCR产物的熔解曲线峰值在89.18 ℃，GAPDH基因PCR产物的熔解曲线峰值在86.63 ℃，每一循环内选择于82 ℃采集荧光信号，两个基因扩增均可排除引物二聚体的干扰。

2.4 TNFRSF10C基因相对表达量（SF/正常）结果

表1显示，7例SF样本的TNFRSF10C基因表达上调，3例下调。

表1 TNFRSF10C基因相对表达量real-time PCR检测结果

3 讨论

本课题组前期采用博奥公司晶芯系列双通道人表达谱芯片，采用1:1配比病例对照研究，探讨了SF发病期外周血基因表达谱的改变。在筛选到的22个SF差异表达基因中，TNFRSF10C基因表达差异最显著，SF组比对照组上调3.96倍。TNFRSF10C基因是TNF受体超家族成员之一，该受体含有一个细胞外TRAIL结合区和一个跨膜区，两者结合后共同发挥生物学效应。TNFRSF10C基因表达与TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）表达密切相关［4］。大量文献研究显示，TRAIL是TNF配体家族的成员［5］，一方面TRAIL可以结合护骨素（osteoprotegerin，OPG），从而中和OPG具有的“减少骨吸收，增加骨密度”的骨保护作用［6-8］；另一方面TRAIL又是与细胞凋亡有关的细胞因子，高表达的TNFRSF10C对TRAIL进行调节，提示可能通过启动细胞凋亡的途径来调节成骨细胞或破骨细胞的数量，从而影响SF的发生发展。这一结果进一步证实了骨组织是一动态组织，应力作用于骨时，骨会发生适应性的塑形改变，从而激活破骨过程（旧骨吸收）和成骨过程（新骨形成）。当骨吸收过程超过骨形成过程，骨质变得疏松，易于骨折［9］。因此，芯片结果提示我们TNFRSF10C基因表达上调可以作为SF发生的潜在预警信号。

为验证芯片结果的可信性，本实验采用实时荧光定量PCR方法检测了10例SF病例及对照外周血的TNFRSF10C基因表达，结果显示，10例样本中有7例TNFRSF10C基因表达上调，上调倍数从1.4倍至6.7倍。其中两例差异较大，上调倍数（6.7、3.5）接近或超过芯片水平；两例上调倍数（2.4、2.2）大于2；3例上调倍数小于2（1.4、1.6、1.8）。另有3例SF样本TNFRSF10C基因表达分别下调50%、90%和90%。这表明SF组TNFRSF10C基因表达变化趋势与芯片结果基本一致。本次选择的SF病例为发病早期，症状较轻，这可能是造成3例样本TNFRSF10C基因表达上调趋势小于芯片结果的原因。另外，前期芯片实验的SF病例及对照均先与共同参照物比较，消除个体差异后才对差异基因进行分析，故可能由于本次验证实验选取的1:1配比病例对照个体差异较大，造成3例SF样本TNFRSF10C基因表达下调。

SF是运动员及军人职业训练中常见的运动损伤，早期诊断是预防的关键。因此，SF的生物标志物研究具有重要的现实意义，但目前只有少数研究报道了某些SF血清生化标志物［10，11］，我们前期的芯片实验筛选得到的差异表达基因TNFRSF10C为SF早期诊断提供了RNA水平的线索。本研究在此基础上，建立了TNFRSF10C基因的实时荧光定量检测方法，并验证了10例SF病例及对照外周血TNFRSF10C基因表达差异情况。本研究结果为进一步探讨SF发病机制及发现早期诊断生物标志物提供了方向，对运动员及战士训练伤防治具有重要意义。下一步研究应尽力克服取材困难，在较大样本范围内对前期芯片结果予以验证。

［1］Warden SJ，Hurst JA，Sanders MS，et al. Bone adaptation to a mechanical loading program significantly increases skeletal fatigue resistance. J Bone Miner Res，2005，20（5）：809-816.

［2］赵化冰，王毅铮，兰晓霞，等.基因芯片筛选应力性骨折差异表达基因.中华劳动卫生职业病杂志，2010，28（11）：34-38

［3］吴在德，吴肇汉. 外科学.第6版. 北京：人民卫生出版社，2007. 860-861.

［4］Kimberley FC，Screaton GR. Following a TRAIL：update on a ligand and its five receptors. Cell Res，2004，14（5）：359-372.

［5］Pan G，Ni J，Wei YF，et al. An antagonist decoy receptor and death domain-containing receptor for TRAIL.Science，1997，277（5327）：815-818.

［6］Colucci S，Brunetti G，Cantatore FP，et a1.The death receptor DR5 is involved in TRAIL-mediated human osteoclast apoptosis. Apoptosis，2007，12（9）：1623-1632.

［7］Greil R，Anether G，Johrer K，et al.Tuning the rheostat of the myelopoietic system via Fas and TRAIL. Crit Rev Immunol，2003，23（4）：301-322.

［8］Simonet WS，Lacey DL，Dunstan CR，et a1. Osteoprotegerin：a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell，1997，89（2）：309-319.

［9］Kiuru MJ，Pihlajamaki HK，Ahovuo JA. Bone stress injuries. Acta Radiol，2004，45（3）：317-326.

［10］陈耀明，齐宗利，吴端宗，等. 兔应力性骨折形态学和肌匀浆磷脂酶A2活性的改变. 解放军预防医学杂志，200l，19（5）：328-331.

［11］刘朋，齐进如，王峥春. 应力性骨折与血清碱性磷酸酶关系及其诊断分析. 现代中西医结合杂志，2001，10（5）：396-398.