HPLC法测定甲状旁腺激素1-34原料药中有关物质的含量

余邦良，杨柳，王秀玲（1.海南医学院药学院，海口市 571101；.海南紫杉园药业有限公司，海口市 57016）

甲状旁腺激素1-34用于绝经后女性骨质疏松症，能增加患者骨密度并降低脊椎与非脊椎骨折的风险[1，2]，而且其作用强于阿仑膦酸钠[3，4]；同时，其也可以用于提高男性原发性骨质疏松症或性腺功能减退的骨质疏松症患者的骨量。该药治疗范围包括原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症和具有骨质疏松引发骨折病史的患者，或有多种诱发骨折的风险及以往的骨质疏松症针对性治疗方法对其失败或无法耐受的患者[5，6]。甲状旁腺激素1-34注射剂作为一种全新的抗骨质疏松药物，由美国Lilly公司研发成功，并于2002年12月在美国上市，商品名Forteo[7]。但该品种目前在我国没有上市。由于甲状旁腺激素1-34是采用固相合成的多肽物质，精制纯化后可能会存在相关肽类杂质，而这些杂质的存在会影响药品的质量，所以需要在原料药标准中建立其有关物质的检测项。本文采用高效液相色谱（HPLC）法测定甲状旁腺激素1-34原料药中有关物质的含量，并进行了方法学研究。

1 仪器与试药

Waters 2695型HPLC仪、Waters 2996二极管阵列检测器、Waters Millennium32色谱工作站（美国Waters公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）。

甲状旁腺激素1-34对照品（美国Peptide公司，批号:M10029B1，含量:99.7%）；甲状旁腺激素1-34原料药（地奥集团成都药业股份有限公司，批号:100201、100202、100203，含量分别为99.4%、99.3%、98.9%）；乙腈为色谱纯，氯化钾为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18（250mm ×4.6mm，5 μm）；流动相:0.05 mol·L－1氯化钾水溶液（pH4.5，磷酸调节）-乙腈＝75∶25；流速:1.0mL·min－1；检测波长:210 nm；柱温:室温；进样量:20μL。

2.2 溶液的制备

供试品溶液:取甲状旁腺激素1-34原料药适量加水溶解并稀释制成每1mL中含甲状旁腺激素1-341.0mg的溶液，作为供试品溶液。

对照品溶液:取经五氧化二磷干燥至恒重的甲状旁腺激素1-34对照品适量加水溶解，制备成每1mL中约含甲状旁腺激素1-341.0mg的溶液，作为对照品溶液。

自身对照溶液:精密量取上述供试品溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 系统适用性试验

精密量取供试品溶液20μL，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱。在上述色谱条件下，理论板数以甲状旁腺激素1-34计在2000以上。甲状旁腺激素1-34与相邻杂质峰的分离度≥1.5。

2.4 专属性试验

2.4.1 酸破坏样品溶液:精密称取甲状旁腺激素1-34原料药适量，加6 mol·L－1的盐酸溶液2mL，使其溶解后，放置在水浴中加热30min，放冷，用1 mol·L－1氢氧化钠溶液调至中性后，用水稀释成每1mL中约含1.0mg的甲状旁腺激素1-34溶液。

2.4.2 碱破坏样品溶液:精密称取甲状旁腺激素1-34原料药适量，加1 mol·L－1的氢氧化钠溶液2mL，使其溶解后，放置在水浴中加热1 h，放冷，用1 mol·L－1盐酸溶液调至中性后，用水稀释成每1mL中约含1.0mg的甲状旁腺激素1-34溶液。

2.4.3 氧化破坏样品溶液:精密称取甲状旁腺激素1-34原料药适量，加3%的过氧化氢溶液2mL，溶解后，用水稀释成每1mL中约含1.0mg的甲状旁腺激素1-34溶液。

2.4.4 光破坏样品溶液:取甲状旁腺激素1-34原料药，置于4000 lx的灯光下照射48 h，精密称取适量，用水稀释成每1mL中约含1.0mg的甲状旁腺激素1-34溶液。

2.4.5 高温破坏样品溶液:取甲状旁腺激素1-34原料药，置于130℃环境中放置2 h，冷却，精密称取适量，用水稀释成每1mL中约含1.0mg的甲状旁腺激素1-34溶液。

精密量取上述各种破坏溶液20μL进样测定，记录色谱。结果，经酸、碱、氧化、光和高温破坏后的供试品溶液的色谱中均有不同程度的杂质峰产生，且均与主成分峰分离良好，因此该色谱条件满足有关物质检查的系统适用性要求。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.酸破坏样品；D.碱破坏样品；E.氧化破坏样品；F.光破坏样品；G.高温破坏样品；1.甲状旁腺激素1-34；2、3、4.杂质Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.sample；C.sample destroyed by acid；D.sample destroyed by base；E.sample destroyed by oxidation；F.sample destroyed by light；G.sample destroyed by high temperature；1.PTH 1-34；2，3，4.impurities

2.5 峰纯度检查

分别取“2.4”项下的5种破坏溶液各20μL进样测定，经二极管阵列检测器检测，其主成分峰的纯度为999.996（阈值为950），表明主成分峰未包含其他杂质峰。

2.6 最小检出量的确定

取甲状旁腺激素1-34对照品适量，用水溶解并稀释至每1mL中含25 ng的溶液，精密量取该溶液20μL注入液相色谱仪测定，记录色谱。结果S/N＝3，最小检出量为0.5 ng。

2.7 线性关系考察

由于甲状旁腺激素1-34有关物质的对照品不易获得，在假设主成分与各杂质的影响因子均相同的前提下，考察杂质量在自身对照溶液浓度附近变化时的线性规律[8]。吸取对照品溶液0.5、1、2、3、4、5mL分别置于100mL容量瓶中用水稀释定容。精密吸取上述不同浓度的溶液各20µL注入液相色谱仪，记录色谱，测定峰面积。以进样浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程:Y＝1.517×104X－5.158×102（r＝0.99996）。结果表明，甲状旁腺激素1-34有关物质检测浓度线性范围为5～50µg·mL－1，即杂质量在该浓度范围内变化时，用自身对照溶液进行定量，能够得到比较准确的结果[9]。

2.8 稳定性试验

取“2.2”项下供试品溶液于室温下放置，分别于0、2、4、6、12 h进样20µL分析。结果，供试品溶液的主成分峰及杂质峰的峰面积均基本一致，RSD＝0.49%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.9 样品中有关物质的含量测定

取3批样品，按“2.2”项下方法制备供试品和自身对照溶液；精密量取自身对照溶液20μL，注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主峰高为满量程的20%；再精密量取供试品溶液和自身对照溶液各20μL进样，记录色谱至主成分峰保留时间的4倍。按主成分自身对照法以峰面积计算杂质的量。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，各杂质峰的面积之和不得大于自身对照溶液主峰面积。结果，3批样品中有关物质含量均小于0.29%，详见表1。

表1 3批样品中有关物质检测结果Tab 1 Results of content determination of the related substances in 3 batches of samples

3 讨论

3.1 波长的选择

对甲状旁腺激素1-34对照品溶液于二极管阵列检测器上200～400 nm波长范围内扫描，结果显示甲状旁腺激素1-34在210、280 nm波长处均有吸收峰。因此，将检测波长分别设为210、280 nm时进行色谱比较，结果显示在这2个波长下杂质的种类和含量没有明显变化。但根据文献[10]报道，多肽类样品的检测波长多采用210或214 nm，故选择测定波长为210 nm。

3.2 流动相的选择

3.2.1 流动相组成的影响:廖海明等[11]采用流动相A（水-乙腈-三氟乙酸＝990∶10∶1）、流动相B（水-乙腈-三氟乙酸＝10∶990∶1），梯度洗脱，在215 nm波长处测定甲状旁腺激素1-34的含量；梁成罡等[12]采用流动相A（0.1%三氟乙酸水溶液）、流动相B（含0.1%三氟乙酸的乙腈-水＝95∶5），梯度洗脱，在214 nm波长处测定甲状旁腺激素1-34的含量。但这2种方法所使用的流动相pH值实际上小于2，超过一般反相色谱柱的pH使用范围（2～8）[13，14]，易导致硅胶相连的化学键合相水解脱落[14]，因而对色谱柱损害较大；同时这2种方法采用梯度洗脱，对色谱柱要求较高；所需洗脱时间相对长，前者主峰出峰时间为15min左右，根据要求测定有关物质的全程洗脱时间达60min，而后者主峰出峰时间为25min左右，根据要求测定有关物质的全程洗脱时间达100min。为此，笔者在水相中加入氯化钾，并用磷酸调节pH值，等度洗脱，大大缩短了分析时间，而且能满足系统适用性要求，因此用此流动相进行试验。

3.2.2 流动相pH的影响:甲状旁腺激素1-34对酸较稳定，对碱不稳定[12]，笔者将流动相中0.05 mol·L－1氯化钾水溶液的pH值用磷酸分别调至2.0、4.5、6.0，考察其色谱行为，结果pH值在4.5时拖尾因子最小，分离效果最好。

3.2.3 流动相中有机溶剂浓度的影响:乙腈量为10%时，主峰保留时间较长，这样不仅浪费时间，而且也浪费昂贵的有机流动相；而乙腈量增加到40%时，主峰保留时间太短，主峰理论板数达不到要求，且与杂质的分离不符合要求；当乙腈量为25%时，保留时间适中，主峰理论板数符合要求，与杂质的分离也符合要求。故确定水相与乙腈相比例为75∶25。

综上所述，所建立的方法简便、准确、灵敏度高、专属性强，可用于甲状旁腺激素1-34原料药中有关物质的含量测定。

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