RNA干扰沉默Cyclin D1基因对胰腺癌AsPC-1细胞增殖和凋亡的影响

肖卫东，李 勇，李学明，蔡 军，邓 君，曾林山，胡 伟

(南昌大学第一附属医院，南昌330006)

近年研究显示，细胞周期失控与肿瘤发生、发展密切相关，而调控细胞周期诸多因素的核心是细胞周期蛋白(Cyclin)与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)。Cyclin D1为G1期细胞周期素，在许多恶性肿瘤组织中均有异常表达，并与肿瘤发生、发展及预后密切相关。2009年1月～2010年12月，我们观察了RNA干扰(RNAi)技术沉默Cyclin D1基因表达对胰腺癌AsPC-1细胞增殖、周期及凋亡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 胰腺癌AsPC-1细胞株(上海细胞生物研究所细胞库)，pSilencer2.1-U6-neo质粒，Cyclin D1-小干扰 RNA(siRNA)和阴性对照 siRNA质粒(本实验室前期研究制备，并经BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序分析证实);T4 DNA连接酶，抗人 Cyclin D1单克隆抗体，感受态大肠杆菌DH5α，碘化丙啶(PI)，逆转录试剂盒，DMEM 培养基，Trizol RNA分离试剂和 LipofectamineTM2000，SYBR ® Green PCR Core Reagents。

1.2 siRNA转染AsPC-1细胞 用含有10%FBS的DMEM培养液在37℃、5%CO2培养箱中常规培养AsPC-1细胞，至对数生长期后以2×105/孔接种于96孔培养板中，并随机分为实验组、阴性对照组、空白对照组，采用LipofectamineTM2000脂质体分别转染Cyclin D1-siRNA、阴性对照siRNA、脂质体，siRNA终浓度为40 nM，每组设3个复孔。转染6 h后更换成DMEM培养液，继续常规培养，48 h时收集细胞。

1.3 AsPC-1细胞Cyclin D1 mRNA表达检测 采用荧光定量RT-PCR法。PCR引物采用Primer Express 2.0软件设计，上海博亚生物技术有限公司合成。Trizol法提取1.2各组样本细胞总RNA，用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA。采用SYBR®Green PCR试剂盒进行PCR反应，总反应体系为25 μl，其中含 10 × Buffer、MgCl2、dNTP 混合物(10 mmol/L)、Taq酶、UNG 酶、引物(目的基因/内参/空白)、cDNA模板、DEPC-H2O，于RT-PCR仪中进行反应。PCR反应条件为50℃孵育2min，95℃ 10min，95℃变性15 s，52℃退火延伸60 s，共40个循环。实验重复3次。由PCR反应曲线得到域值循环数(Ct)，以 GAPDH作为内参照，计算 Cyclin D1 mRNA相对表达量(RQ 值)=2-ΔΔCt。

1.4 AsPC-1细胞 Cyclin D1蛋白表达检测 采用Western blot法。收集1.2各组细胞，蛋白提取液提取蛋白，Bradford法测蛋白含量。每泳道25 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转NC膜，鼠抗人Cyclin D1(1∶200)过夜，二抗(1∶5 000)室温孵育 1 h，DAB 显色，Bio-Rad凝胶成像系统摄影。以β-actin作为参照。Quantity One软件分析Cyclin D1与β-actin条带的灰度比值(%)，即Cyclin D1蛋白相对表达量。

1.5 AsPC-1细胞体外增殖活力检测 采用MTT法。取1.2细胞，转染24 h前按每孔5×103个细胞传代至96孔培养板，其后按上述分组及方法转染，转染6 h后加入完全培养基，培养12、24、48、72 h后每孔加入质量浓度为5 g/L的MTT 30 μl，37℃作用4 h，用PBS洗2次后每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡15min使结晶充分溶解。在酶标仪测定570 nm波长下的吸光度值(OD值)。以OD值为纵坐标，培养时间(h)为横坐标绘制细胞生长曲线。

1.6 AsPC-1细胞周期及凋亡率(AI)检测 采用流式细胞仪法。转染48 h后收集1.2各组106个细胞，离心，冷PBS清洗细胞2遍，将细胞用1 ml注射器快速推入70%冷乙醇中，4℃固定12 h以上。PBS洗2遍，调整细胞浓度为1×104/ml，用 RNase消化后PI染色，混匀后流式细胞仪进行单参数分析，用累积曲线分割法计算各期细胞所占比例。G1峰前面出现的亚2倍体峰即为凋亡峰，用吖啶橙染色凋亡细胞。

1.7 统计学方法 用SPSS11.0软件进行统计学处理。经方差齐性检验后两组间均数比较采用t检验，两个样本率的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 AsPC-1细胞Cyclin D1 mRNA及蛋白相对表达量 ①Cyclin D1 mRNA:实验组、阴性对照组、空白对照组Cyclin D1 mRNA相对表达量分别为0.27±0.03、0.99±0.08、1.00±0.11，实验组显著低于空白对照组和阴性对照组(P均＜0.01)，而两组比较无明显差异;与空白对照组比较，实验组Cyclin D1 mRNA抑制率为73.6%。②Cyclin D1蛋白:实验组、阴性对照组、空白对照组Cyclin D1蛋白相对表达量分别为(13.0±2.6)%、(75.5±6.8)%、(73.6±6.2)%，实验组显著低于空白对照组和阴性对照组(P均＜0.01)，两组比较无明显差异;与空白对照组比较，实验组Cyclin D1蛋白抑制率为82.3%。

2.2 AsPC-1细胞体外增殖情况 转染后24～72 h，实验组细胞生长速度较空白对照组和阴性对照组明显减慢(P均＜0.01)，后两组细胞生长无明显差异，见图1。

图1 三组AsPC-1细胞生长曲线

2.3 AsPC-1细胞周期分布和AI 三组AsPC-1细胞周期分布和AI见表1。

表1 三组 AsPC-1细胞周期分布及AI(±s，%)

表1 三组 AsPC-1细胞周期分布及AI(±s，%)

注:与其他两组比较，*P＜0.01

组别 G0/G1 S G2/M AI实验组 93.46±4.17* 2.64±0.62* 3.90±1.83* 25.4±1.82*阴性对照组 50.88±1.26 35.22±0.84△ 13.90±0.36 4.2±0.64空白对照组45.23±1.87 38.15±1.33 16.62±0.51 2.9±0.33

3 讨论

目前发现的调节细胞周期的Cyclin有A、B1及B2、C、D1～D3、E、F、G、H 等十余种，其中 Cyclin D1与G1期关系最为密切。正常情况下，Cyclin D1蛋白仅在G1早期呈一过性表达，半衰期约20min，其与细胞周期素依赖激酶-4/6(CDK4/CDK6)结合形成的复合物可驱动细胞由G1期进入S期，促进细胞增殖［1，2］;Cyclin D1 表达异常可导致细胞增殖周期失调，DNA提前复制，促使细胞发生癌变。文献报道［3～6］，在胰腺癌组织中 Cyclin D1蛋白的表达率为62.3%～72%、Cyclin D1 mRNA表达率高达82%，而正常胰腺组织中几乎未见阳性表达，且Cyclin D1过度表达与胰腺癌预后呈负相关。因此，Cyclin D1可作为胰腺癌基因治疗的潜在靶点之一。

RNAi是应用双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达使其沉默的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默(PTGS)。RNAi作为一种简单、快速关闭特定基因功能的技术，是实现基因治疗的有力工具之一。蒋磊等［7］报道转染siRNA-Cyclin D1可有效抑制乳腺癌MCF细胞株中Cyclin D1表达，使细胞周期阻滞于G1期，从而抑制细胞增殖。在对白血病 K562细胞［8］、瘢痕疙瘩成纤维细胞［9］和人结肠癌细胞株HT-29［10］等的研究中也有类似报道。本研究显示，实验组Cyclin D1 mRNA和蛋白表达量均显著低于其余两组。表明本实验中设计合成的针对Cyclin D1基因靶序列的siRNA能有效沉默目的基因表达。本实验还显示，与其他两组比较，实验组细胞生长速度明显减缓，S期细胞比例明显下降，G0/G1细胞比例明显增加，AI显著上升;空白对照组和阴性对照组细胞周期及AI无显著差异。提示靶向沉默Cyclin D1基因表达可显著改变细胞周期分布、促进细胞凋亡;阴性对照质粒对Cyclin D1基因表达、AsPC-1细胞周期分布和细胞凋亡并无明显影响。

综上所述，Cyclin D1-siRNA能通过沉默靶基因表达抑制AsPC-1细胞生长、改变细胞周期分布、诱导细胞凋亡，可作为胰腺癌基因治疗的一个有效靶点。

［1］Sherr CJ.Cancer cell cycles［J］.Science，1996，274(5293):1672-1677.

［2］Vermeulen K，Van Bockstaele DR，Berneman ZN.The cell cycle:a review of regulation，deregulation and therapeutic targets in cancer［J］.Cell Prolif，2003，36(3):131-149.

［3］Gansauge S，Gansauge F，Ramadani M，et al.Overexpression of cyclin D1 in human pancreatic carcinoma is associated with poor prognosis［J］.Cancer Res，1997，57(9):1634-1637.

［4］Kawesha A，Ghaneh P，Andrén-Sandberg A，et al.K-ras oncogene subtype mutations are associated with survival but not expression of p53，p16(INK4A)，p21(WAF-1)，cyclin D1，erbB-2 and erbB-3 in resected pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Int J Cancer，2000，89(6):469-474.

［5］Poch B，Gansauge F，Schwarz A，et al.Epidermal growth factor induces cyclin D1 in human pancreatic carcinoma:evidence for a cyclin D1-dependent cell cycle progression［J］.Pancreas，2001，23(3):280-287.

［6］Lebe B，Sagol O，Ulukus C，et al.The importance of cyclin D1 and Ki67 expression on the biological behavior of pancreatic adenocarcinomas［J］.Pathol Res Pract，2004，200(5):389-396.

［7］蒋磊，陈日曙，李继承.siRNA-cyclinD1对乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用［J］.分子细胞生物学报，2006，39(2):118-122.

［8］万一元，刘扬清，陈小飞.Cyclin D1基因沉默对K562细胞增殖及凋亡的影响［J］.肿瘤学杂志，2008，14(1):48-52.

［9］梁大宁，高建华，鲁峰.瘢痕疙瘩成纤维细胞生长与小干扰RNA分子抑制细胞周期蛋白D1表达的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(2):241-244.

［10］丁健，李丹，王承党，等.RNA干扰阻断cyclin D1表达抑制结肠癌细胞增殖［J］.世界华人消化杂志，2007，15(34):3572-3576.