人硫氧还蛋白基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

苏 伟 高 枫 龚少愚 魏慧渊 孙茂民 江家贵 (南京中医药大学无锡附属医院，江苏 无锡 2400)

硫氧还蛋白(TRX)是一类分布广泛的小分子多功能蛋白，在细胞内行使着各种不同的功能〔1〕。TRX与其还原酶及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH)构成的氧化还原系统介导氢的传递，亦可单独作为蛋白质二硫键氧化还原发挥作用，对许多蛋白质的功能进行调节〔2，3〕。TRX有强烈的清除体内过氧化物的功能，在机体抗氧化过程中起着重要的作用〔4，5〕，对防止心脑器官缺血再灌注损伤性有重要作用〔6〕。人TRX(human thioredoxin，hTRX)基因定位于3p12-p11，基因全长13 kb，其保守区为318 bp，开放阅读框架编码了含104个氨基酸组成蛋白质〔7，8〕。为探讨hTRX基因的生物学活性及其在内皮细胞氧化应激过程中的作用，本文拟克隆并构建hTRX的真核表达载体，为后续研究的开展提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 RNA抽提试剂盒、TaqDNA聚合酶、限制性核酸内切酶 EcoR I、BamH I、dNTPs、MgCl2均购自大连宝生物工程公司。逆转录试剂、pcDNA3.0质粒购自上海申能博彩生物科技制品有限公司。DH5α菌株由本室保存，pUCm-T Vector载体试剂盒购自Promega公司。正常人胎肝取自水囊引产之胎儿(4月龄)。中国人民解放军苏州100医院妇产科。hTRX引物P1:5'-CGGAATTCATGGTGAAGCAGATCGAGAGC-3'，P2:5'-CGGGATCCGATTAGACTAATTCATTAATG-3'。上游引物5'端设有DNA限制酶(EcoRⅠ)酶切位点，下游引物:5'端含限制性核酸内切酶Ⅰ(BamHⅠ)酶切位点。引物参考GenBank的hTRX基因序列(J04026)设计，由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR扩增hTRX cDNA ①取胎儿肝组织约150 mg，参照RNA抽提试剂盒手册进行总RNA的提取。②取3 μl总 RNA，15 mmol/L Oligo(dT)18 加入 2 μl，65℃ 作用5 min;然后加入5×RT缓冲液4μl，10 mmol/L dNTPs 2μl和0.5μl RNA酶抑制剂，1μl逆转录酶(M-MLV)逆转录酶，最后加双蒸水至总体积为20μl，置37℃水浴1 h，90℃处理10 min后，获得cDNA模板。③ 取 cDNA 模板2μl，P11μl，P21μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，10 × Reaction Buffer 5 μl，MgCl23 μl，TaqDNA 聚合酶1 μl，dd H2O 35 μl，扩增体积为 50 μl，置 PCR仪中扩增。首先94℃ 3 min预变性，然后进行下列循环:94℃45 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，共 32 个循环，最后 72℃ 延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 重组pUCm-T/hTRX质粒的构建与鉴定 将hTRX cDNA与pUCm-T载体进行体外连接(参照Promega公司T载体系统说明书进行)，然后转化DH5α感受态细菌，用抗性筛选法挑选阳性菌落并进行测序，取测序正确的重组质粒进行扩增。

制备DH5α大肠杆菌感受态细胞并转化。过程如下:①取活化的DH5α按1%接种入30 ml LB培养基中振荡培养，至OD值为0.3左右。②倒入50 ml离心管中0℃，10 min。→4℃，5 000 r/min，离心 5 min。→弃上清，振松菌块，加入 8 ml 100 mmol/L预冷 CaCl2，0℃，30 min。→4℃，5 000 r/min，离心5 min。→弃上清，振松菌块，加入200μl 100 mmol/L预冷CaCl2。③按下表进行转化:

表1 质粒转化及分组

④0℃，30 min。→ 42℃，90 s。→0℃，2 min。→ 加37℃预热的LB 1 ml。→37℃，45 min摇动震荡培养。⑤5 000 r/min，离心5 min，弃上清。留100μl混悬液分别涂布平板，37℃置隔水式恒温培养箱。⑥待实验组平板有蓝白菌落生长时，从中挑取白色单菌落接种于5 ml 1%LB中，37℃，震荡培养过夜。⑦用V-gene公司质粒抽提试剂盒提取质粒。

1.2.3 hTRX克隆基因序列分析 以阳性克隆重组质粒cDNA为模板，选择T7测序引物，双脱氧终止法测定克隆基因序列。

1.2.4 pcDNA3.0/hTRX真核重组质粒的构建 用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切经测序验证的pUCm-T/hTRX质粒DNA，回收目的hTRX cDNA基因片段，将其定向克隆至经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切的pcDNA3.0真核表达质粒上，以常规氯化钙法转化DH5α感受态细胞，用PCR和双酶切分析法鉴定重组子。双酶切反应:体系①pMD18-T 10 μl，10 ×Buffer 5 μl，EcoRⅠ 0.9 μl，BamHⅠ 0.7 μl，ddH2O 33.4 μl共 50 μl。②pcDNA3.0 10 μl，10× Buffer 5 μl，EcoR Ⅰ 1.0 μl，BamH Ⅰ 0.8 μl，ddH2O 31.2μl，共50μl。在37℃作用3～5 h，随后进行核酸琼脂糖电泳，用V-Gene公司胶回收试剂盒分别回收hTRX cDNA片段和pcDNA3.0载体分别经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后用于连接反应。基因重组连接反应体系:hTRX cDNA片段3μl，双酶切的pcDNA3.0 1.5 μl，10 × Buffer 1 μl，T4 DNA 连接酶 0.8 μl，ddH2O 3.7 μl，共10 μl，16℃ ～18℃连接过夜，以备转化。后续的转化、酶切及PCR鉴定方法同hTRX克隆载体部分相同。

1.2.5 pcDNA3.0-hTRX转染非州青猴肾细胞(COS-7)细胞

接种COS-7细胞于6孔板，3×106个细胞/孔，37℃，5%CO2条件下孵育18～24 h至60% ～80%融合度，然后用无血清DMEM将上述贴壁COS-7细胞洗1～2次，加入预先混合30 min的溶液 A:pcDNA3-ING4 6 μl、DMEM 94 μl;B:Lipofectamine 8 μl、DMEM 92 μl。于37℃、5%CO2条件下孵育5 h，补加1 ml DMEM含20%胎牛血清(FCS)/孔，继续孵育18～24 h，换液为DMEM(10%FCS)，37℃，5%CO2条件下继续培养24～72 h后收集COS-7细胞(4℃保存备用)，同时以同样的方法将pcDNA3.0空载体转染的COS-7细胞作空白对照。

1.2.6 COS-7细胞中hTRX mRNA的检测 转染72 h后，分别收集实验组hTRX基因重组质粒和空载体质粒转染的COS-7细胞，Trizol提取细胞总RNA，以此RNA为模板按常规法合成cDNA第一链，用上述引物的常规PCR法扩增hTRX编码区cDNA。具体反应条件为 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，热循环32次，最后72℃延伸10 min。产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

2 结果

2.1 PCR扩增hTRX基因 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，显示为一约335 bp的片段，与理论预测结果相符。见图1。

图1 RT-PCR扩增产物凝胶电泳分析

2.2 重组质粒pUCm-T/hTRX的鉴定 pUCm-T/hTRX质粒经PCR和双酶(EcoRⅠ、BamHⅠ)切法鉴定均出现335 bp大小的条带，表明重组载体构建正确。见图2。

2.3 扩增hTRX基因测序与分析 测序结果与已发表的序列和基因库数据相比完全一致。

2.4 重组真核表达载体pcDNA3.0/hTRX的鉴定 pcDNA3.0/hTRX经PCR和双酶切(EcoRⅠ、BamHⅠ)鉴定均出现了335 bp大小的条带，测序结果同克隆测序结果，表明真核表达载体构建正确。见图3。

图2 重组质粒的PCR及酶切鉴定

2.5 hTRX基因在转染COS-7细胞中的表达检测 经RT-PCR检测证实hTRX基因转染细胞内有hTRX mRNA表达，而转染空白载体pcDNA3.0的细胞内无hTRX mRNA表达。见图4。

图3 重组真核表达载体的PCR及酶切鉴定

图4 RT-PCR鉴定hTRX mRNA

3 讨论

Wollman等首次从3B6EB病毒转化的人淋巴母细胞B细胞(3B6 Human EBV Lymphoblastoid B Cell Line)克隆hTRX基因全长cDNA序列。Kaghad等从λEMBL4嗜菌体人类基因文库中分离出hTRX全长cDNA片段。hTRX基因长达13 kb并含有5个外显子被4个内含子分开，编码12 kD的蛋白质。Southern分析表明在人类基因组中存在几种hTRX基因，但至少其中之一是无活性的假基因〔7〕。同植物和细菌的 TRX一样，hTRX具有高度保守的酶活性中心:Trp-Cys-Gly-Pro-Cys。活性中心的二巯基可被可逆的氧化形成二硫键，并可通过这个过程来控制靶蛋白中二硫键或二巯基的形成，调控靶蛋白的活性与功能。研究发现，其活性部位CXXC存在于许多具有类似活性的蛋白质中〔8，9〕，但是，hTRX与大肠杆菌TRX的活性中心不同，其活性中心还有另外的三个半胱氨酸，该结构赋予hTRX独特的生物活性。已证实成人T白血病细胞的自分泌生长因子——成人T细胞衍生因子(ADF)即为hTRX。

因为mRNA编码hTRX在细胞分裂活跃的组织中高表达，所以，以胎肝细胞RNA为模板，根据hTRX基因已知序列设计引物，用RT-PCR方法扩增出hTRX成熟蛋白基因片段。经克隆后测序分析比较，结果与Gasdaska等从HT 29结肠癌肉瘤细胞、Lalop EB病毒转换化的人淋巴母细胞(Lalop Human EBV Lymphoblastoid Cell Line)和正常人肝组织提取的hTRX cDNA序列完全相同。克隆序列与Genbank提供的hTRX cDNA序列完全相同。王应等通过对从人胚肝细胞来源的hTRX c DNA序列分析，发现其只包含了hTRX的第1，2，4，5个外显子，第3个外显子(60 bp)被完整地剪切掉，其他核酸序列及另外六种模板来源的hTRX cDNA序列与Genbank提供的相同〔10〕。编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因的克隆成功，为进一步研究其功能活性提供了条件。

真核表达载体是基因转导的理想载体，阳离子脂质体介导法又以其转染效率高、无免疫原性、整合和扩散性小、操作简便、容量大而受到国内外学者关注。本实验中构建了hTRX真核表达载体，经PCR、双酶切和基因测序结果均表明重组载体pcDNA3.0/hTRX构建正确，为进一步研究hTRX基础。

作为一种真核瞬时表达系统，COS-7细胞是研究蛋白质结构与功能的有利工具，多种载体可在COS-7细胞中表达外源基因〔11〕。本文采用成功构建的真核表达载体pcDNA3.0/hTRX转染宿主细胞系COS-7对hTRX基因的真核表达进行了初步研究。RT-PCR检测证实hTRX基因至少在转录水平上有表达。为进一步pcDNA3.0-hTRX转染内皮细胞，探讨hTRX基因的生物学活性及其在内皮细胞氧化应激过程中的作用奠定了基础。

1 Kamata H，Hirata H.Redox Regulation of celluar signalling〔J〕.Cell Signal，1999;11(1):1-14.

2 Hirota K，Nlatsui M，Murata M.Nucleoredoxin，glutaredoxin，and thioredoxin differentially regulate NF-kappaB，AP-1，and CREB activation in HEK293 cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;274(1):177-82.

3 Baker A，Payne CM，Briehl MM，et al.Thioredoxin，a gene found overexpressed in human cancer，inhibits apoptosis in vitro and invivo〔J〕.Cancer Res，1997;57(22):5162-7.

4 Kim YC，Masutani H，Yamaguchi Y，et al.Hemin-induced activation of the thioredoxin gene by Nrf2〔J〕.J Biol Chem，2001;276(21):18399-406.

5 Sano H，Sata T，Nanri H，et al.Thioredoxin is associated with endotoxin tolerance in mice〔J〕.Crit Care Med，2002;30(1):190-4.

6 Takagi Y，Mitsui A，Nishiyama A，et al.Overexpression of thioredoxin in transgenic mice attenuates focal ischemic brain damage〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(7):4131-6.

7 Tonissen KF，Wells JR.Isolation and characterization of human thioredoxin-encoding genes〔J〕.Genes，1991;102(2):221-8.

8 Nigam SK，Goldberg AL，Ho S，et al.A set of endoplasmic reticulum proteins possessing properties of molecular chaperones includes Ca2+binding proteins and members of the thioredoxin superfamily〔J〕.JBio Chem，1994;269(3):1744-9.

9 Gasdaska PY，Oblong JE，Cotgreave IA，et al.The predicted amino acid sequence of human thioredoxin is identical to that of the autocrine growth factor human adult T-cell derived factor(ADF):thioredoxin mRNA is elevated in some human tumors〔J〕.Biochim Biophys Acta，1994;121(3):292-6.

10 王 应，王玉刚，张颖妹，等.人硫氧还蛋白存在不同的选择性剪切形式〔J〕.科学通报，1998;43(1):63-7.

11 Davis L，Kuehl M，Battey J.Basic methods in molecular biology(2nd edition)〔M〕.Norwalk，Connecticut:Appleton＆Lange，1993:237-45.