人参皂苷Rg3对兔耳增生性瘢痕中Caspase-3、细胞色素C表达的影响

刘鹤松 王 芳 吴 杰 赵自然 (吉林大学第一医院皮肤性病科，吉林 长春 130021)

病理性瘢痕(Pathological Scar，PS)是整形外科研究的重点及难点，随着对其发生、发展机制的深入研究，发现细胞凋亡在病理性瘢痕形成中起着重要的作用。人参皂苷Rg3(GSRg3)是从人参中分离提纯的一种单体，为四环三萜类人参二醇型皂苷〔1〕。目前国内外关于GS-Rg3的研究主要是针对肿瘤的治疗，大量研究表明GS-Rg3能促进肿瘤细胞凋亡，并抑制其转移。最近研究发现Caspase-3、细胞色素C对细胞凋亡的形成起重要作用，与瘢痕增生密切相关〔2，3〕。本实验通过建立兔耳增生性瘢痕模型，研究GS-Rg3对兔耳增生性瘢痕Caspase-3、细胞色素C的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 大耳白兔24只，雌雄不拘，体重(2.5±0.2)kg，吉林大学实验动物中心提供。根据时间分为2 w、4 w、6 w实验组三组及对照组。

1.2 主要仪器及试剂 主要仪器:高精度轮转式石蜡切片机，购自日本的LAICA。电热恒温干燥箱购自中国上海实验仪器总厂。石蜡包埋机、恒温孵化箱购自日本的SANYO。显微镜购自日本的OLYMPUS。CO2孵箱购自美国SHEL LAB;酶标仪购自美国BIO-RAD。免疫组化试剂盒、DAB显示试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。主要试剂:GS-Rg3来自吉林大学基础医学院。柠檬酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH6.0)、0.01 mol/L(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)为吉林大学白求恩医学院配制。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的制备 用速眠新注射液0.2～0.3 ml/kg肌肉注射。麻醉生效后，消毒兔耳腹面皮肤，切除2 cm×2 cm的全层皮肤，每耳4～6处。将动物编号，分笼饲养。3 w后创面形成凸起的增生性瘢痕组织。于四组动物耳部增生性瘢痕组织处行局部封闭注射，实验组注射GS-Rg3(浓度6 mg/2 ml)，对照组注射等体积的0.9%生理盐水，三天一次。分别于用药后2 w、4 w、6 w切取瘢痕组织，经4%多聚甲醛固定48～72 h，石蜡包埋切片。

1.3.2 实验方法 瘢痕组织立刻经4%多聚甲醛-0.01 mol/L PBS(pH7.4)固定。6 h后，PBS漂洗4～5 h，每小时交换洗液，或4℃冰箱过夜。乙醇常规脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋。用石蜡切片机连续切片，每片标本4μm厚，HE染色、免疫组化法中的链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)染色。PBS为阴性对照。免疫组化染色阳性结果为棕黄色或棕黑色颗粒。每例切片随机选择五个高倍视野，计数每个视野中100个细胞中的阳性细胞数，计算五个视野的平均阳性率。

2 结果

实验组与对照组相比Caspase-3的表达在用药后6 w增加至2.4倍。实验组与对照组相比细胞色素C的表达在用药后6 w增加至2.8倍。增生性瘢痕用药前后细胞色素C、Caspase-3阳性细胞率见表1，图1。

表1 增生性瘢痕用药前后细胞色素C、Caspase-3阳性细胞率比较(%，±s)

表1 增生性瘢痕用药前后细胞色素C、Caspase-3阳性细胞率比较(%，±s)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

24 8.11±4.23 7.93±4.51实验组2 w 24 13.05±4.941) 11.33±3.482)实验组4 w 24 18.66±5.092) 15.82±4.762)实验组6 w 24 23.13±5.762) 19.28±4.052)Caspase-3对照组时间 n 细胞色素C

图1 增生性瘢痕中细胞色素C、Caspase-3阳性表达(免疫组化SP法，×40)

3 讨论

瘢痕是创伤愈合的必然产物，但是过度的瘢痕增生不仅影响美观，严重时可引起组织器官功能障碍，因此成为创伤修复领域的研究热点。研究主要集中在成纤维细胞的增殖与凋亡、胶原的合成与降解、细胞因子的调节。其中细胞凋亡研究备受关注，细胞凋亡不仅参与正常创伤愈合的组织重建，而且与增生性瘢痕的形成、消退密切相关;凋亡不足亦是引起增生性瘢痕的原因之一。GS-Rg3是从人参中提取的单体，为四环三萜类人参二醇型皂苷。目前国内外关于GS-Rg3的研究主要针对肿瘤的治疗，治疗瘢痕的报道较少。

Caspases是一种半胱氨酸蛋白酶，而且具有天门冬氨酸的活性，是白细胞介素1-β转化酶家族(ICE/CED-3)中的重要成员。它是一组与线虫CED-3同源的调控哺乳动物细胞凋亡、具有14个成员的蛋白酶家族〔4〕，对细胞凋亡的形成起重要作用。凋亡发生机制中最关键的环节之一是Caspase的激活。Caspase蛋白家族以非活性的前体形式存在于细胞质中，当被切断后才成为活性蛋白酶。近年来，许多实验证实细胞色素C可激活Caspase。Caspase-3属于Caspase超家族成员，在细胞凋亡过程中起着非常重要的作用。细胞色素C在细胞凋亡中的作用近几年来才引起人们的注意。细胞色素C是线粒体呼吸链中的一个基本成分，通过抵抗多种形式的细胞死亡而延长细胞寿命，使细胞数目累积增多，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控。细胞色素C是一种可溶性蛋白，正常位于线粒体膜内，并松散地附着于线粒体膜的内表面。当细胞色素C从细胞线粒体转移到胞浆，一旦胞质中出现细胞色素C，其可与细胞质中的其他成分相互作用，激活Caspase，诱导细胞凋亡的发生。

本实验利用免疫组化方法检测增生性瘢痕中Caspase-3及细胞色素 C表达，结果显示:GS-Rg3可明显增加细胞质中Caspase-3及细胞色素C表达，与对照组相比用药后6 w分别增加至2.4倍及2.8倍。表明GS-Rg3先导致线粒体细胞色素C释放量增加，然后激活Caspase耦联，最终导致细胞凋亡。最近也有研究发现人的增生性瘢痕组织中Caspase-3蛋白表达降低，细胞凋亡受阻。所有这些发现更进一步证实了细胞色素C和Caspase的激活在增生性瘢痕治疗中的作用。Zhivotovsky等采用显微注射的方法将细胞色素C注入到肿瘤细胞、大鼠上皮细胞、小鼠胚胎成纤维细胞，也可导致这些细胞发生凋亡。若先将这些细胞与Caspase抑制剂孵育一段时间后，再注入细胞色素C于胞浆中，则几乎不会发生细胞凋亡，说明细胞色素C的作用依赖于Caspase，它通过激活Caspase而导致细胞发生凋亡〔5〕。

Caspase正常情况下以非活性形式存在于细胞质中，这种非活性形式可被蛋白水解酶切断而激活。由线粒体内膜释放到细胞质中的细胞色素C作为辅助因子参与Caspase-3的激活;Caspase-3活化后，识别并降解其底物，使得一些处于静止状态的促凋亡因子被激活，Caspase可截断凋亡细胞与周围细胞的联系，破坏重组细胞骨架，阻止DNA复制和修复，干扰DNA、RNA的拼接，破坏核结构，诱导凋亡细胞出现吞噬的信号，使细胞成分降解并形成凋亡小体，一些与DNA损伤修复、RNA剪切、DNA转录相关的蛋白因子被裂解失活〔6，7〕。因此Caspase-3一经激活并导致底物裂解，细胞凋亡将不可逆地进行下去。

综上所述，增生性瘢痕的形成受到多种因素的影响，可能是多个基因与外源性因素共同作用的结果，GS-Rg3可明显上调Caspase-3及细胞色素C的表达，能够诱导成纤维细胞凋亡。

1 王本祥.人参研究进展〔M〕.天津:科学技术出版社，1991:97-9，125-53.

2 窦德强，靳 玲，陈英杰.人参的化学成分及药理活性的研究进展与展望〔J〕.沈阳药科大学学报，1999;16(4):151-6.

3 王鸿彪，林英城.人参皂苷Rg3抗肿瘤作用研究进展〔J〕.医学综述，2009;15(3):323.

4 Yuan J，Shaham S，Ledoux S，et al.The C.elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme〔J〕.Cell，1993;75(4):641.

5 Wassermann RJ，Polo M，Smith P，et al.Differential production of apoptosis-modulating proteins in patients with hypertrophic burn scar〔J〕.J Sur Res，1998;75(1):74.

6 Enarl M，Talanian RV，Wong WW，et al.Sequential activation of ICE-like and CPP32-like proteases during Fas-mediated apoptosis〔J〕.Nature，1996;380(4):723.

7 Akasaka Y，Ishikawa Y，Ono I，et al.Enhanced expression of caspase-3 in hypertrophic scars and keloid:induction of caspase-3 and apoptosis in keloid fibroblasts in vitro〔J〕.Lab Invest，2000;80(2):34.