姜黄素对人结肠癌SW620细胞凋亡机制的影响

罗 强 孙 黎 张 力 刘 华 刘开扬 (河北北方学院实验中心，河北 张家口 075000)

结肠癌是常见恶性肿瘤，我国是结肠癌的高发国家。随着经济发展，生活方式的改变，结肠癌的发病日渐增多。在发病率上升的同时，结肠癌发病年龄趋向老龄化〔1，2〕。老年结肠癌在临床、病理特征、治疗及预后等方面与中青年有所不同，如:症状隐匿，发展较慢，恶性度较低、误诊率高，并发症较多，术后并发症常见，直接影响老年结肠癌的治疗和预后。老年结肠癌是临床非常常见的恶性肿瘤，近年发病率有进一步升高。有研究表明〔3～5〕，姜黄素能抑制多种体外培养的肿瘤细胞如食道癌、乳腺癌、肝细胞癌和肾癌等多种肿瘤细胞的生长及增殖，并诱导细胞凋亡，但姜黄素对结肠癌细胞上述方面作用的研究报道较少。本研究主要通过姜黄素对人结肠癌细胞增殖凋亡作用来探讨抗肿瘤效应可能与细胞凋亡相关基因表达的调控有关。从分子生物学水平揭示作用机制，为姜黄素进一步研究开发及临床治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器 人结肠癌细胞株(SW620)由河北医科大学惠赠。无血清细胞冻存培养基(RPMI1640)(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川页生化制品有限公司)，CCK-8(上海同仁化学)，碘化丙啶(PI)(深圳晶美生物工程有限公司);异硫氰酸荧光素(FITC-p53)、PE-bcl-2(美国BD公司)。美国Spectra-Max M2e多功能微孔板检测系统，美国FACSA ria流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 SW620细胞培养 细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2条件下培养。取对数生长期细胞用不同浓度姜黄素处理。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖抑制 取对数生长期的SW620细胞5×104/ml接种于96孔培养板，100μl/孔。用RPMI1640培养液将姜黄素稀释成 5个不同浓度(0.25，0.5，0.75，1.0，1.2 mmol/L)，分别加入96孔培养板(100μl/孔)，每组设4个复孔，对照组加入等体积培养液，置37℃、5%CO2培养24 h。然后每孔加入CCK-8 20μl继续培养4 h，之后用 SpectraMax M2/M2e多功能微孔板检测系统测吸光度(A490值)，按公式计算细胞抑制率:抑制率(%)=(1-实验组平均A490值/对照组平均A490值)×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 将培养至对数生长期密度为1×106/ml SW620细胞分别接种于6个50 ml的培养瓶，1.5 ml/瓶，待细胞贴壁后，分别加入上述5个不同浓度的姜黄素悬液1.5 ml，对照组加入1.5 ml培养液，37℃、5%CO2培养24 h后，1 500 r/min，离心7 min收集细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗涤3次，最后1次移入1 ml离心管中，PI染色30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 流式细胞仪检测p53，bcl-2蛋白表达 取对数生长期SW620细胞(密度为1×106/ml)分别接种于4个50 ml的培养瓶中，贴壁后换不同浓度的姜黄素培养液(0.25，0.5，0.75 mmol/L)，对照组加入等量培养液，培养24 h后，收集细胞，分别加入20μl FITC-p53及PE-bcl-2孵育20 min，上流式细胞仪检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行数据处理，数据用±s表示，两组均数间比较采用t检验。

2 结果

2.1 姜黄素对SW620细胞增殖的影响 CCK-8法检测0.25，0.5，0.75，1.0，1.2 mmol/L 5个不同浓度的姜黄素作用 SW620细胞24 h，对SW620细胞的生长均得到明显的抑制，并且随着药物浓度增加，对SW620细胞抑制率增加且生存率下降，分别为 19.05%、28.13%、40.95%、43.81%、51.43%;80.95%、71.87%、59.05%、56.19%、48.57%。与对照组相比差异均有显著性(P＜0.01)。

2.2 姜黄素对SW620细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测经不同浓度姜黄素处理的SW620细胞，均出现一个亚二倍体的凋亡峰，其峰值(即凋亡细胞的细胞数与总细胞数的比值)随姜黄素浓度增高逐渐增高。其峰值分别为5.53%、7.12%、10.34%、21.14%及29.68%。对照组无亚二倍体凋亡峰，见图1，图2。

2.3 姜黄素对SW620细胞p53和bcl-2表达的影响 经0.25，0.5，0.75 mmol/L 3个不同浓度的姜黄素作用SW620细胞24 h后，与对照组相比，p53表达明显增高，bcl-2表达显著降低，用药前后均有显助性差异，且姜黄素对SW620细胞的作用呈剂量依赖性。见表1。

图1 对照组流式检测结果

图2 0.75 mmol/L姜黄素组流式检测结果(↘为凋亡峰)

表1 姜黄素对SW620细胞p53和bcl-2蛋白表达的影响(%)

3 讨论

姜黄是一种常见的中药〔6〕，从姜黄中提取的酚性色素姜黄素是姜黄的主要有效成分，具有多方面的药理作用，有消炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、降血脂等作用〔7〕。姜黄素的抗癌机制是多方面的，其中诱导肿瘤细胞凋亡的机制受到人们的广泛关注。姜黄素可以抑制P-糖蛋白的功能和表达，激活半胱天冬酶-3，对多药耐药性人类胃癌细胞系(SGC7901)/长春新碱(VCR)起逆转作用〔8〕，孙军等〔9〕通过姜黄素作用于人肝癌细胞株(BEL-7402)的实验研究证实，姜黄素可通过蛋白酶体途径减少人肝癌细胞缺氧诱导因子(HIF-1α)蛋白的表达。研究表明，姜黄素可以上调p53丝氨酸磷酸化和Bax的水平，同时下调Bcl-2、半胱天冬酶前体-3(pro-caspase-3)和半胱氨酸前体-9(pro-caspase-9)的水平，从而诱导结肠癌细胞(HT-29)的凋亡，提示其可作为一种有效的治疗结肠癌的药物〔10〕。

CCK-8法检测5个不同浓度的姜黄素作用SW620细胞24 h，对SW620细胞的生长有不同程度的抑制作用，并且随着药物浓度增加，对SW620细胞抑制率也增加、生存率下降。目前认为细胞凋亡的处罚是一个有多基因参与的级联式表达结果，药物诱导肿瘤细胞凋亡受一个或多个基因的调控。癌基因在正常细胞就存在，且在生理状态下参与细胞的正常生长、分化及代谢过程。抑癌基因是一列可以抑制细胞生长并能潜在抑制癌变的基因〔11〕。癌基因与抑癌基因参与肿瘤的发生、发展，癌基因增强细胞增殖，导致肿瘤发生，抑癌基因诱导凋亡清除癌变细胞，凋亡基因和抑癌基因广泛用于癌症的基因治疗〔12〕。流式细胞术结果表明姜黄素具有上调抑癌基因p53的表达，下调癌基因bcl-2的表达作用，而诱发SW620细胞凋亡。

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