线粒体氧化应激在心肌缺血性损伤中的作用

潘奇正 张 蕾 吴金义 (吉林大学公共卫生学院，吉林 长春 3002)

冠心病是由于冠状动脉粥样硬化或血管痉挛使管腔狭窄或阻塞而导致心肌缺血、缺氧，引起的心肌损伤或坏死。大量证据表明，在缺血早期出现心肌细胞死亡主要由细胞凋亡介导的，而非细胞坏死〔1〕。但心肌缺血性损伤的病因和发病机制目前并不完全清楚。目前认为，氧自由基和炎性细胞因子介导的损伤在心肌缺血过程中发挥重要作用。本文就线粒体氧化应激对心肌缺血性损伤的作用机制进行实验观察。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠16只，雄性，体重180～200 g，由吉林大学基础医学院动物部饲养。

1.1.2 主要试剂和仪器 盐酸异丙肾上腺素(ISO，上海禾丰制药厂)，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，肌酸激酶(CK)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，GF-D 200型半自动生化分析仪(山东高密彩虹分析仪器公司)。8-羟基脱氧鸟苷(8-OhDG)购自日本JAICA公司;半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)购自美国Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及心肌缺血缺氧损伤模型制作 将大鼠随机分为两组，每组8只。对照组腹腔注射等量生理盐水;实验组给予ISO 5 mg/kg腹腔注射，每隔24 h重复注射1次，连续注射3 d。对照组与实验组于第3次注射后24 h处死。

1.2.2 大鼠血清样本的制备 分别于处死大鼠前穿刺尾静脉或断尾获取外周血1 ml，3 000 r/min(r=6 cm)，离心5 min，取上清，再于高速低温离心机13 000 r/min(r=6 cm)，离心15 min，取上清，-20℃冻存备用。

1.2.3 心脏病理组织学检测标本的制备 第3次注射后24 h处死对照组和实验组大鼠，消毒后取出心脏，放入磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗，10%甲醛溶液固定;经常规石蜡包埋后做4μm连续切片，进行HE和免疫组织化学染色(SP法)。

1.2.4 结果判定 以心肌细胞质、胞核出现棕黄色颗粒，着色强度高于背景染色者判定为阳性，无则为阴性。由两名观察者独立完成判断，二者若存在矛盾，则两者在显微镜下共同观察解决。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，各组数据采用±s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 大鼠血清心肌酶学检测 LDH检测结果显示，ISO处理组血清LDH活性升高，实验组与对照组相比差异显著(P＜0.01);CK检测结果显示，ISO处理组血清CK活性升高，实验组与对照组相比差异显著(P＜0.01)。见表1。

表1 各组血清CK和LDH活性比较(±s)

表1 各组血清CK和LDH活性比较(±s)

与对照组比较:1)P＜0.01

组别 n CK(U/ml) LDH(U/L)对照组8 43.69±4.82 4 317.60±690.82 ISO组 8 58.32±5.761) 6 762.70±786.761)

2.2 各组大鼠心肌缺血缺氧损伤的病理组织学观察 HE染色显示对照组心肌横纹清晰，核居中，未见组织坏死、血管扩张及炎细胞渗出与浸润。实验组心内膜内皮不完整，在心肌细胞间可见小血管的扩张及少量红细胞渗出，部分心肌细胞肿胀、变性坏死，心肌组织内可见血管扩张、炎细胞渗出、浸润及其包绕血管形成的血管周围炎。见图1。

图1 各组心肌H＆E染色(×400)

图2 各组8-OhDG免疫组织化学染色(×400)

2.3 8-OhDG免疫组化染色结果 如图2所示，对照组注射生理盐水后3 d大鼠心肌中无阳性物质;注射ISO后3 d后心肌细胞胞浆8-OhDG表达明显高于对照组。

2.4 Caspase-3免疫组化染色结果 对照组注射生理盐水后3 d大鼠心肌中无阳性物质;注射ISO后3 d后心肌Caspase-3表达明显高于对照组。见图3。

图3 各组Caspase-3免疫组织化学染色(×400)

3 讨论

大剂量ISO导致心脏β1受体过度兴奋，心率加快，心肌收缩力增加，心肌耗氧增加;β2受体兴奋，扩张外周血管，降低外周血管阻力，血压降低，特别是舒张压降低，减少冠状动脉供血，结果使心肌缺血缺氧〔2〕。缺血性心肌酶的释放量是心肌损害程度的主要标志，本研究发现，间隔24 h，连续3次，腹腔注射给予ISO后血清CK、LDH活性增高，表明此方法能够完全模拟心肌损伤的病理生理过程，复制心肌损伤的模型。心肌病理学检查更是心肌缺血损害程度的直接证据。心肌代谢，特别是氧的供需矛盾，是冠心病的重要病理生理变化。心肌缺血可导致心肌内出现大量的氧自由基，过量的氧自由基损伤细胞的蛋白，脂质和DNA，并诱发炎症反应〔3～5〕。而线粒体DNA由于缺乏组蛋白的保护，更易受到氧化应激损伤〔6〕。本实验使用DNA 氧化应激损伤特异性标记 8-OhDG〔7，8〕，结果发现，8-OhDG阳性表达于胞浆，说明线粒体DNA受到损伤，而非细胞核DNA损伤。HE染色显示心肌细胞发生变性坏死，伴有大量炎细胞浸润;免疫组织化学染色见部分心肌细胞表达Caspase-3。这些结果表明，心肌缺血导致大量氧自由基的释放，使线粒体DNA损伤，影响线粒体呼吸链功能，导致细胞能量代谢障碍，激活Caspase-3细胞凋亡途径，引起心肌细胞发生不可逆性损伤甚至坏死。因此，采用ISO诱导的大鼠心肌损伤模型，能够模拟缺血性心脏病的发病。其机制在于氧化应激导致的心肌细胞线粒体DNA损伤，并通过Caspase-3路径诱导心肌细胞凋亡。本研究对于心肌缺血缺氧的发病机制提供了新视点，以保护线粒体为切入点，为临床对症治疗提供了新思路。

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