缺血后处理对大鼠骨骼肌缺血再灌注肾损伤ICAM-1表达的影响及其意义

张彦荣 高 翔 蔡建辉 (河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000)

缺血-再灌注损伤(IRI)不仅损伤肢体局部组织，而且可影响远隔的内脏器官，引起多器官功能衰竭，危及生命〔1〕。下肢缺血再灌注引起的急性肾损伤是临床上常见且严重的并发症，发生机制复杂。有研究显示，骨骼肌IRI早期，氧自由基、炎性因子的作用是导致远隔肾损伤的主要原因。本实验通过对大鼠后肢肌肉IRI后肾损伤进行研究，观察细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达变化，初步探讨骨骼肌IRI致远隔肾损伤的部分机制及缺血后处理的保护效果。

1 材料与方法

1.1 动物 健康清洁级Wistar大鼠24只，雄性，体重200～250 g，由河北医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 ECL化学发光试剂盒、RIPA组织蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒均为美国Pierce公司产品，小鼠ICAM-1单克隆抗体、小鼠β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠IgG均购自北京博奥森生物技术有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒由南京建成生物工程研究提供。

1.3 分组 将24只大鼠随机分为4组，每组6只，Ⅰ组为对照组，只进行麻醉不阻断血流;Ⅱ组为缺血4 h无再灌注组;Ⅲ组为缺血4 h再灌注6 h;Ⅳ组为缺血3 h 57 min并于再灌注前给予1 min灌注、1 min缺血，重复3次后再灌注5 h 57 min。

1.4 模型制备 1 g/L拉坦(5 mg/kg)腹腔注射麻醉下，以橡皮带环绕结扎大鼠双后肢根部，使后肢缺血4 h，去除止血带实现再灌注〔2〕。按各组设定时间处理动物，分别取材。

1.5 BUN及SOD检测 按实验设计时间处理动物，经心脏穿刺取血，留血清，采用全自动生化分析仪检测BUN含量。取肾组织匀浆，检测SOD含量，按试剂盒说明进行。

1.6 免疫组织化学染色 采用SP法对四组肾组织进行免疫组织化学染色。肾小管上皮细胞胞质内出现淡黄色、棕黄色、棕褐色颗粒者为阳性细胞。观察阳性细胞染色深浅及染色范围，判断ICAM-1的表达情况。

1.7 Western印迹分析 首先进行蛋白质提取和分离，转膜后分别与一抗、二抗反应进而显色。运用美国Kodak公司黑马凝胶分析系统软件对Western印迹结果进行定量分析，采集积分光密度值(IOD)，结果以目的基因与β-actin的IOD比值表示。

2 结果

2.1 四组大鼠血清BUN及肾组织匀浆SOD含量比较 各组SOD变化明显，Ⅱ组较Ⅰ组明显下降(P＜0.05)，III组较Ⅱ组下降更为明显(P＜0.05)，后处理组(Ⅳ组)较Ⅱ组低，较III组显著升高(P＜0.05)。Ⅱ组与Ⅰ组比较BUN含量无显著差异(P＞0.05)，Ⅲ组BUN水平明显升高，后处理组相应下降，与Ⅲ组比较有显著性差异(P＜0.05)。见表1。

表1 大鼠血清BUN及肾组织SOD含量比较(±s)

表1 大鼠血清BUN及肾组织SOD含量比较(±s)

与Ⅱ组比较:1)P＜0.05;与Ⅲ组比较:2)P＜0.05

组别 n BUN(mmol/L) SOD(U/mg.pro)Ⅰ组 6 2.08±0.49 22.58±1.791)Ⅱ组 6 2.16±0.57 19.03±1.90Ⅲ组 6 10.30±1.971) 11.92±1.171)Ⅳ组 6 4.92±0.922) 15.95±0.791)2)

2.2 各组肾组织免疫组化染色结果 I组肾小管上皮细胞未见阳性产物，Ⅱ组可见肾小管上皮细胞少量细颗粒棕色产物，Ⅲ组可见肾小管上皮细胞大量深棕色颗粒状阳性产物，Ⅳ组可见阳性产物表达减轻呈灶性分布。见图1。

2.3 Western印迹检测结果 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组ICAM-1蛋白表达水平较Ⅰ组均有增加，以Ⅲ组最高，与Ⅰ组比较有显著性差异(P＜0.05)，Ⅳ组与Ⅲ组比较亦有显著性差异(P＜0.05)。见图2。

图1 各组大鼠肾组织ICAM-1表达(SP，×200)

图2 各组肾组织中ICAM-1蛋白表达的Western印迹分析

3 讨论

肢体IRI后继发的肾损伤发生机制复杂。有研究认为，肾损伤的主要发病原因是肾小管内形成的肌红蛋白管型堵塞肾小管所致。随着目前研究的不断深入，发现由肌红蛋白在酸性环境下(pH＜5.6)解离出亚铁血红素的作用更为重要，它可通过脂质过氧化作用使自由基增多，从而直接损伤肾小管上皮细胞〔3〕。过多的自由基可直接损伤肾小球毛细血管内皮细胞，使肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞变性、坏死，最终肾小球滤过率下降导致急性肾衰竭〔4〕;同时氧自由基还可激活核因子-κB信号传导通路，造成细胞因子、黏附分子等过度表达。ICAM-1属免疫球蛋白超家族成员，介导白细胞和血管内皮细胞黏附以及白细胞穿过血管壁的过程，在IRI中同样起着重要的作用。由ICAM-1介导的白细胞与血管内皮细胞相互黏附是白细胞聚集、活化和释放炎性介质的关键〔5，6〕。SOD是一种天然的抗氧化酶，是清除体内氧自由基的最主要成分。IRI时，由于氧自由基生成增多，SOD被大量消耗，因此SOD的增多是体内氧自由基产生减少的有力佐证。本实验中IRI组BUN明显增高，SOD显著下降，肾损伤程度加重，ICAM-1表达增强，说明了氧自由基及ICAM-1参与了骨骼肌缺血再灌注肾损伤。因此，对抗氧自由基产生并抑制炎性细胞向组织浸润，是防止IRI较为有效的方法。

缺血后处理是组织缺血后再灌注前给予短时间多次重复灌注-停灌处理后，继续再灌注的一种处理方式，是近年来提出的通过调动机体内源性保护机制减轻组织器官IRI的新措施。本实验中，与缺血再灌注组比较，缺血后处理组SOD明显增加，BUN显著下降，结合肾组织中ICAM-1蛋白的检测结果，说明缺血后处理可以明显减少自由基的产生及炎性细胞浸润，对骨骼肌缺血再灌注肾损伤具有保护作用。有关缺血后处理阻断ICAM-1及氧自由基产生的具体途径仍有待进一步研究。

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4 Rubinstein I，Abassi Z，Milman F，et al.Hyperbaric oxygen treatment improves GFR in rats with ischemia/reperfusion renal injury:a possible role for the antioxidant/oxidant balance in the ischemic kidney〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2009;24(2):428-36.

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6 夏 康，李家兵，吴建伟，等.丹红注射液对大鼠移植肾缺血再灌注损伤后ICAM-1表达的影响〔J〕.重庆医科大学学报，2010;35(2):199-201.