血管生成素-1对HCT-8细胞的作用及其可能机制的研究

张继红,温春阳,于晓艳,李相军,尹 丽,任立群*

(1.吉林大学药学院,吉林 长春130021;2.北华大学附属医院;3.北华大学医学部)

近些年来,随着分子生物学的发展及对大肠癌的机制研究的不断深入,如何针对基因的靶向治疗已成为热点。Ang-1作为血管生成素(Ang)家族的一种,据国内外文献报道,主要是通过Ang-1/Tie-2信号系统促进血管内皮细胞的生存,起到抗凋亡的作用,但是对于此通路Tie-2后途径仍不清楚,据Kim[1]等研究推测,其抗凋亡的机理可能与PI3’-kinase/Akt调节的通路有关。我们应用Western blotting方法检测其对HCT-8细胞中的Tie-2、PI3K以及Akt三种蛋白的激活情况,并加入PI3’-kinase的抑制剂LY294002进一步检测三种蛋白的表达,旨在发现Ang-1对HCT-8细胞的作用及其分子机制,为大肠癌的分子靶向治疗提供一些参考。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人结肠癌细胞株HCT-8(北京药物研究所),DMEM培养基(Gibco),Ang-1(Pepretech),Western blotting检测试剂盒、LY294002、GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz),Tie-2多克隆抗体、PI3K多克隆抗体、Akt多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司),即用型SP免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物工程公司),蛋白质marker(Solarbio),其余均为国产或进口分析纯试剂。

1.2 细胞分组

1.2.1正常对照组(C组)用含15%胎牛血清的DMEM培养液培养。

1.2.2细胞凋亡组(0组)用无胎牛血清的DMEM培养液培养。

1.2.3血管生成素-1组(Ang-1组):在0组培养液基础上加入Ang-1(根据实验结果选定后续实验Ang-1的浓度为0.2 mg/L)。

1.2.4LY294002组(阻断剂LY294002+Ang-1组):在Ang-1组培养液基础上加入阻断剂LY294002。

1.3 MTT法检测条件培养基中细胞增殖情况

不同浓度的细胞消化后接种至6孔板。血清的培养基同步24 h后加入条件培养基,培养24 h后,组织细胞裂解液反复吹打,裂解后,加凝胶上样缓冲液,加热、离心,稀释后,于260 nm及 280 nm处测定吸光度值(A)。……