乙酰胆碱对离体豚鼠心房肌细胞IKAch的影响

费 瑜,李淑梅,祝金明,吴 迪

(吉林大学第二医院,吉林 长春130041)

近来人们对自主神经功能紊乱与心律失常发病的关系越来越引起重视。有学者观察到[1,2]灌注乙酰胆碱(acetylcholhe,Ach)到心脏可对心房与心室功能活动产生抑制作用,诱发心房纤颤(atrial fibrillation,AF)。1985年Allessie等[3]对犬的迷走神经进行刺激,结果观察到有AF的发生,证实迷走神经活动增强可诱发出AF。Ach是迷走神经的递质,通过与M受体结合发挥其作用,但它与IKAch的关系尚不十分清楚。为此,本实验观察Ach对离体豚鼠心房肌细胞乙酰胆碱敏感钾电流(IKAch)的变化,旨在进一步研究迷走神经引起心律失常的机制。

1 材料与方法

1.1实验药品胶原酶I型(sigma),HepEs(american Biotec),EGTA(sigma),牛磺酸(taurine,sigma),氯化镉(sigma)。

细胞贮存液(mmol/L):KOH 70,L-谷氨酸 50,KCl 40,牛磺酸 20,KH2PO420,MgCl23.6,glucose 10,EGTA 0.5,用1 mmol/L KOH 调节pH至7.4。

记录IKAch的电极外液成分(mmol/L):NaCl 136,KCl 5.4,MgCl21.0,HEPES 10,glucose 10,pH值用5 mmol/L NaOH调至7.4。记录时在电极外液加入CaCl2(200 μ mol/L)阻断钙电流和钙激活的氯电流;用Glyburide(10 μ mol/L)和电极内液的 Mg-ATP(5 mmol/L)阻断ATP敏感钾通道;chromanol 293B(20 μ mol/L)和 E-4031(5 μ mol/L)分别阻断 Iks和 Ikr通道;4-AP除外Ito的干扰。

记录IKAch的电极内液成分(mmol/L):KCl 20,天冬氨酸110,MgCl21,HEPES 10,EGTA 5,MgATP 5,Glucose 11,pH值用1 mmol/L KOH调至7.2。

分离细胞所用的溶液:

无钙台氏液(mmol/L):NaCl 143,KCl 5.4,MgCl26,H2O 0.5,NaH2PO42,HEPES 5。pH=7.4。

有钙台氏液(mmol/L):NaCl 143,KCl 5.4,CaCl22,H2O 1.8,MgCl26,NaH2PO42,HEPES 5。pH=7.4。

酶溶液:无钙台氏液+8 mg/60 ml collagenase

细胞贮存液(mmol/L):KOH 70,L-谷氨酸50,KCl 40,牛磺酸 20,KH2PO420,MgCl26,glucose 10,HEPES 10,EGTA 0.5,用1 mmol/L KOH 调节pH至7.4。

1.2实验仪器倒置显微镜(Olympus,日本),膜片钳放大器(Ddangan 8800Total Clamp美国),微电极拉制器(NARISHIGE日本),液压微电极推进器(NARISHIGE日本),防震台(TMC美国),显微镜摄像机(JVC日本),监视器(Panasonic日本),模数/数模转化器(Axon日本),恒流蠕动泵(兰格 BT01-100中国),恒湿水浴箱(DR-HW-1型 中国),离心机(7LDZ5-2型)。

中国记录分析软件(Patch Clamp 6.01美国)。

1.3实验方法

1.3.1豚鼠心房肌细胞的急性分离 选用健康成年豚鼠(由吉林大学实验动物中心提供),体重250-350 g,雌雄不拘,击头致昏后迅速开胸暴露心脏,剪断心脏与周围的连接,保留好主动脉,从主动脉根部离断取出心脏放入4℃有钙台氏液中,小心去除脂肪、心包膜及结缔组织。……