Dnd1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

李顺东 ，于 淼 ，张 勇 ，邓 来 ，谭宇婷 ，程 洁 ，彭小宁

（1.长沙市第三医院，湖南 长沙 410005，2.湖南师范大学医学院，3.中南大学湘雅二医院，湖南 长沙410006）

小鼠Dnd1基因第一个睾丸生殖细胞瘤(TGCT)易感基因，研究表明Dnd1基因在进化中具有保守性[1]，因此Dnd1一定具有重要的生物学功能。近年来，尽管国际同行相继发现Dnd1与Apobec3相互作用[2]，Dnd1参与 miRNAs的活性调控[3]，但该基因在睾丸生殖细胞瘤发生中的调控作用及其分子机制仍不清楚。我们实验室首次发现过表达Dnd1抑制细胞增殖和诱导细胞周期G1期阻滞[4]，为了反向证明这一重要的体外生物学功能，我们构建Dnd1基因RNAi慢病毒载体，以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达，从而为深入研究Dnd1细胞分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

慢病毒载体系统购自上海吉凯基因化学技术有限公司，包括pGCSIL-GFP载体，pHelper 1.0载体和 pHelper 2.0载体，pGCSIL-GFP载体含有能持续表达小RNA的元件，同时能表达荧光蛋白，pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体含有病毒包装所必须的元件。E.coli DH5α感受态细胞为本实验室保存；PCR试剂盒购自promega公司，引物由上海吉凯基因技术有限公司合成，Taq DNA聚合酶为TaKaRa产品;质粒重组所用限制性内切酶Age I和 EcoR I，连接酶T4 DNA ligase为 NEB公司产品;琼脂糖凝胶购自赛百盛公司；DNA抽提试剂盒购自QIAGEN公司；DMEM低糖培养基干粉购自Gibco公司，标准小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；包装细胞293T购自上海吉凯基因化学技术有限公司。其他试剂均购自上海生物工程公司和北京鼎国公司。

1.2 方法

1.2.1 Dnd1基因干扰序列的设计

根据小鼠Dnd1基因mRNA序列 (BC034897)，按照siRNA设计原则用Ambion公司的设计软件，设计4条Dnd1的siRNA序列见表1。……