天津地区儿童急性下呼吸道感染病毒病原学分析*

孔 梅 李晓燕 苏 旭 邹 明 张 桦

婴幼儿呼吸道病毒感染已成为主要的公共卫生问题，而肺炎是发展中国家5岁以下儿童最主要的死亡原因。病毒是引起急性下呼吸道感染（AL⁃RI）中最主要的病原体，近年来随着分子生物学技术的发展，新的呼吸道病毒不断被发现，包括人偏肺病毒（HMPV）、人冠状病毒（CoV）、WU多瘤病毒以及人博卡病毒（HBoV）等病毒。除WU多瘤病毒是否为呼吸道致病原还存在争议外，其余病毒已经证实均为呼吸道致病原。笔者采集了202例住院患儿鼻咽分泌物，进行16种呼吸道病毒检测，以了解天津地区ALRI患儿中的病毒病原学现况。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取天津市儿童医院2008年9月—2009年5月下呼吸道感染的住院患儿202例，年龄6 d～12岁（中位数6.0个月），男140例，女62例。其中肺炎患者179例（88.6%），支气管炎23例（11.4%）。采集鼻咽分泌物后-70℃冻存，并尽快送至实验室。

1.2 病毒RNA/DNA提取 按照Nuclisens easyMAG自动核酸提取仪（BioMetrix，法国）的说明书进行，标本液用量为200 μL，用50 μL洗脱液洗脱，-70℃保存。

1.3 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 采用美国Ferman⁃tas公司试剂盒进行逆转录（按试剂盒说明书操作）。See⁃plexTMRV Detection kit（Seegene，韩国）多重PCR法检测，A管检测腺病毒（ADV），HMPV，CoV 229E/NL63，副流感病毒（PIV）1、2、3；B管检测流感病毒（Flu）A、B，呼吸道合胞病毒（RSV）A、B，鼻病毒（RhinoV）A/B，CoV OC43/HKU1。阳性对照为试剂盒反应液中已加的内对照，阴性对照为无菌水。按试剂盒说明书操作。用2%琼脂糖凝胶进行电泳，上样量为10 μL，使用试剂盒中提供的 RV-A Marker和RV-B Marker，置凝胶成像系统观察结果。HBoV按文献[1]方法检测NP-1基因片段。WU多瘤病毒检测按文献[2]法检测VP2基因片段。

1.4 统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件处理。计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本致病性病毒检出情况 202份样本中151份（74.8%）标本为致病性病毒阳性。RSV检出数最高，为42.1%（85/202），其次为PIV 20.8%（42/202）和RhinoV19.8%（40/202）。其余病毒检出较少，HBoV 14份、CoV 13份、Flu 9份、ADV 10份和HMPV 6份，典型电泳结果见图1。85份RSV阳性检出样本中RSVB为83份，RSVA仅为2份。42份PIV中PIV3型为32份，PIV1为10份，未检测到PIV2。9份Flu均为A型。13份CoV阳性检出样本中血清型OC43/HKU1为6份，229E/NL63为7份。

2.1.1 混合感染 2种以上病毒混合感染54份（26.7%），其中81.5%（44/54）为2种病毒混合感染，18.5%（10/54）为3种及以上病毒混合感染。15种病毒中混合感染率最高的是HBoV为64.3%（9/14），其次是RhinoV为62.5%（25/40），最低的是HMPV为16.7%（1/6）。

2.1.2 不同月份病毒检出情况 9个月期间,标本阳性检出数从2008年12月开始突然增高，至2009年4月逐渐降低。RSV在2008年12月—2009年3月检出率最高，与Flu流行高峰期较一致。PIV除9月末检测到外，其余各月均有检出，且在3月—5月较高。ADV冬季未检测到，从2月开始出现。RhinoV、CoV和HBoV在9个月期间均有检出，未有明显的高峰期，见表1。

表1 不同月份致病性病毒检出情况 （例）

2.1.3 各年龄段患儿病毒检出情况 <6个月患儿病毒感染率80.4%（78/97），6～12个月为76.2%（32/42），12～36个月为 63.0%（29/46），≥36个月为70.6%（12/17）。各年龄段病毒阳性检出率比较差异无统计学意义（χ2=5.19，P>0.05），见表2。

表2 各年龄段患儿病毒检出情况 例（%）

2.2 WU多瘤病毒检出情况 202份样本中有40例（19.8%）WU多瘤病毒阳性，年龄12 d～6岁(中位数11.4个月)，<6个月者17例（42.5%），6个月～1岁者7例（17.5%），1～3岁者14例（35%），≥3岁者2例（5.0%）。2009年3月检出率最高，为52.2%（12/23），2008年12月为26.7%（8/30），2008年11月为22.2%（4/18），其余月份均有检出。

3 讨论

本研究检测ALRI患儿鼻咽分泌物致病性病毒阳性率为74.8%，与Chung等[3]报道结果一致，但高于吴茜等[4]报道昆明患儿病毒检测阳性率（27.2%）和莫运波等[5]报道重庆儿童病毒检测阳性率（47.27%）。国内报道大多为免疫荧光法检测7种呼吸道病毒，本研究病毒阳性率明显高于国内相关报道，考虑可能与采用的检测方法以及检测病毒种类数量不同有关。

本研究ALRI患儿中以RSV检出率最高，这与广州地区报道相同[6]，再一次证实了RSV确为儿童下呼吸道感染的最主要病原。除RSV外，PIV和RhinoV也是导致下呼吸道感染的较主要病原。有部分病毒有季节流行性，Flu虽为冬季流行，但其主要为门诊上呼吸道感染致病病原，在下呼吸道感染住院患儿中检出率仅为4.4%。WU多瘤病毒是否为呼吸道致病病原尚存在争议，但本研究发现在下呼吸道感染患儿中阳性检出率高达19.8%，应当引起关注。

6例HMPV阳性标本中，仅有1例与RhinoV混合感染，在所有致病性病毒中混合感染率最低，表明HMPV与其他常见呼吸道病毒混合感染少见，与Regev等[7]的报道一致。HBoV与其他病毒或细菌的呼吸道病原的合并感染较常发生[8]，有报道与其他病原合并感染率可高达69.2%[9]，本研究结果也显示HBoV与其他病毒混合感染率在所有病毒中最高，为64.3%。

2004年相继发现了属于第1组血清型的CoV HKU1和第2组血清型的CoV NL63，北京报道了CoV NL63在儿童中的感染[10]。本研究中同时检测到这2种新出现的冠状病毒，证实了CoV HKU1和NL63与天津地区婴幼儿急性下呼吸道感染有关系。

本研究采用多重PCR的方法在提高阳性检出率的同时还可以提高检测效率，对病原体快速鉴别诊断、及早治疗具有实用价值。因本研究仅就9个月的监测数据进行了分析，还需进行连续性的监测，以更全面的了解各个病毒的流行趋势。

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