胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究

曹珊珊，牛卫宁，羊梦林，钦传光

(西北工业大学生命学院，陕西 西安 710072)

同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)，又称高半胱氨酸，是一种含巯基的氨基酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物。研究表明，Hcy是导致心脑血管疾病、糖尿病以及神经系统疾病的危险因素[1]，因此，快速准确检测Hcy含量方法的建立，对基础研究和临床诊断都有非常重要的意义。

目前，同型半胱氨酸最主要的检测方法包括高效液相色谱法、荧光偏振免疫法、毛细管电泳-质谱联用法以及电化学法，这些检测方法均存在测定程序复杂、耗时、样品需要预处理以及测试仪器价格昂贵等弊端[2～5]。因此，本实验室拟建立一种通过酶催化测定Hcy的方法，该方法具有快速、方便、灵敏、精确的特点。反应原理如下：Hcy和L-丝氨酸在胱硫醚β-合酶(Cystathionineβ-synthase，CBS)催化下生成L-胱硫醚(L-Cystathionine)，L-胱硫醚又经过胱硫醚β-裂解酶(Cystathionineβ-lyase，CBL)催化生成丙酮酸，丙酮酸在碱性条件下与2,4-二硝基苯肼反应生成棕红色产物，利用分光光度计在520 nm下测定吸光度值即可得到丙酮酸含量[6]，从而计算出样品中Hcy的浓度。

因此，大量表达和纯化CBS和CBL并对其性质进行研究是建立酶催化法测定Hcy浓度的关键，本实验室前期已经对CBS的表达、纯化以及性质进行了系统研究。作者在此构建了高效表达CBL的重组菌E.coliBL21(pETDuet-1-CBL)，一步亲和层析纯化得到CBL，并建立了一种新的CBL酶活性检测方法，同时对重组CBL的酶学性质进行了研究，为酶催化测定Hcy方法的建立奠定了基础。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌种和试剂

大肠杆菌E.coliK12、E.coliDH5α、E.coliBL21，自行保存。……