HPLC法测定藏药螃蟹甲中苯乙醇苷类化合物的含量

李茂星，张 超，乌 兰，尉丽力，邱建国，张泉龙，贾正平(.兰州军区兰州总医院药剂科，全军高原环境损伤防治重点实验室，甘肃兰州 70050;2.兰州大学生命科学学院，甘肃兰州 70000;.西北民族大学化工学院，甘肃兰州 7000)

螃蟹甲为唇形科糙苏属多年生草本植物螃蟹(Phlomis younghusbandii Mukerjee)的干燥块根，藏语称“露木尔”，为藏医习用药材，广泛分布于青海、西藏海拔2 700～4 800 m的地区［1］。传统中医药、民族医药理论认为螃蟹甲具有强筋壮骨、祛风活络、清热消肿、止咳祛痰的功效，广泛用于治疗咳嗽、感冒、肺炎、支气管炎、风湿性关节炎、疮疥肿毒等疾病。现代药理研究其镇咳、祛痰和平喘效果显著，临床应用也非常广泛。作者前期对螃蟹甲的化学成分研究表明螃蟹甲中大量含有环烯醚萜苷和苯乙醇苷类成分，有关螃蟹甲中环烯醚萜苷类化合物的含量测定目前已有文献报道［2，3］，而苯乙醇苷类化合物的含量测定未见报道。药理学研究表明，苯乙醇苷类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆、保肝和强心等作用［4，5］，可能为螃蟹甲中的活性成分。为了更有效地控制螃蟹甲药材及其制剂的质量，本测定首次采用HPLC法对不同产地的螃蟹甲药材和1个螃蟹甲制剂中3个苯乙醇苷类成分的含量进行测定和比较，希望可以为进一步完善该药材的品质评价及质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪，包括600型二元梯度泵、996型二极管阵列紫外检器(美国 Waters公司)，BP210S电子分析天平(Sartorius公司)，SK7200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);甲醇为色谱纯，水为灭菌注射用水，其余试剂均为分析纯;对照品毛蕊花糖苷、alyssonoside、异毛蕊花糖苷均为本实验室自制［从螃蟹甲药材中分离得到，经光谱学和波谱学分析鉴定其结构(图1)，经HPLC面积归一化法计算，纯度均在98%以上］。螃蟹甲对照药材由中国药品生物制品检定所提供(批号为121407-200401)。螃蟹甲药材(3份，分别收购于西藏林芝、拉萨、四川成都，经兰州大学药学院马志刚教授鉴定为螃蟹甲Phlomis younghusbandii Mukerjee)。螃蟹甲制剂七味螃蟹甲丸(0.25 g/粒，青海琦鹰生物制药股份有限公司，国药准字Z20054325，批号20091203)。

图1 螃蟹甲中的3个苯乙醇苷类化合物的结构

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为 Symmetry C18色谱柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm);洗脱流动相为甲醇-水(36∶64)，冰醋酸调 pH 至4.5;流速1.0 ml/min;检测波长330 nm;柱温20℃;进样量10 μl。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取干燥至恒重的毛蕊花糖苷、alyssonoside、异毛蕊花糖苷各25 mg置25 ml量瓶中，加70%的甲醇至刻度。即得浓度为1 mg/ml的对照品储备溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取螃蟹甲药材粉末(过四号筛)1 g，精密称定;取七味螃蟹甲丸8粒，研细，分别置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，称定重量，超声处理45 min，冷却，再称定重量，加70%甲醇补足减失的重量，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。

2.4 系统适用性试验

2.4.1 理论塔板数和分离度 在“2.1”项下的色谱条件下，取混合对照品溶液(毛蕊花糖苷、alyssonoside、异毛蕊花糖苷按浓度2∶1∶1混合)，供试品溶液各10 μl，分别进样，记录色谱图，见图2。在图2中，毛蕊花糖苷、alyssonoside、异毛蕊花糖苷的保留时间分别为 10.0、14.9、17.4 min，与相邻峰的分离度均大于1.5，理论踏板数均大于2 000。

图2 螃蟹甲药材HPLC色谱图

2.4.2 精密度试验 取毛蕊花糖苷、alyssonoside、异毛蕊花糖苷的混合对照品溶液，在“2.1”项下的色谱条件下，重复进样6次，进样量为10 μl，记录峰面积，计算仪器精密度的RSD，结果毛蕊花糖苷、alyssonoside、异毛蕊花糖苷的RSD分别为1.94%、1.20%、0.75%，表明精密度良好。

2.5 线性关系的考察 分别吸取毛蕊花糖苷储备液 100、500、900、1 300、1 700、2 100、2 500 μl;alyssonoside 储备液 50、150、250、350、450、550、650 μl;异毛蕊花糖苷储备液 50、150、250、350、450、550、650 μl;然后分别依次加入到7个5 ml的容量瓶中混匀，加70%的甲醇定容至刻度。即得不同浓度的3种苯乙醇苷混合对照品溶液。然后按“2.1”项下的色谱条件进行测定，分别进样10 μl，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，得各成分回归方程和线性范围见表1。

表1 3个苯乙醇苷的回归方程和线性范围

2.6 重复性试验 取同一产地螃蟹甲样品6份，按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备样品溶液，然后按“2.1”项下色谱条件进行测定，每次进样10 μl，分别测定峰面积，计算含量，结果测得毛蕊花糖苷、alyssonoside、异毛蕊花糖苷含量分别为 3.15、1.10、1.35 mg/g;RSD分别为1.74%、1.99%、1.48%。

2.7 加样回收率试验 精密称取适量已知含量的购自四川成都的螃蟹甲药材粉末6份，分别精密加入一定量的毛蕊花糖苷、alyssonoside、异毛蕊花糖苷对照品，按照“2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验(n=6)

2.8 耐用性

2.8.1 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，每次进样 10 μl，分别在 0、2、4、8、12、24、48、72 h 测定峰面积，结果毛蕊花糖苷、alyssonoside、异毛蕊花糖苷的 RSD分别 1.87%、1.34%、2.71%。表明样品溶液在72 h内基本稳定。

2.8.2 流动相的组成比例和pH值 在研究分析方法的过程中可以看出，流动相中甲醇和水相的比例有小的变动(1%左右)，pH值在4.0～5.0之间变化，对测定结果无明显的影响。

2.9 样品含量测定 分别取不同来源的螃蟹甲样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，进样10 μl，采用外标法以峰面积计算3个苯乙醇苷的含量，结果见表3。

表3 螃蟹甲中3个苯乙醇苷的测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 本实验首次建立了藏药螃蟹甲中苯乙醇苷类化合物的HPLC含量测定方法，并测定了不同产地螃蟹甲药材和1个螃蟹甲制剂中3个苯乙醇苷的含量，方法稳定可靠，重复性好，适合于螃蟹甲的质量控制。

3.2 在供试品制备方法上，考察了甲醇、70%甲醇和50%甲醇对苯乙醇苷提取效率的影响，结果表明以70%的甲醇作为提取溶剂效率最高。在此基础上，比较了热回流和超声对提取结果的影响，结果表明超声法提取效率高。以70%甲醇做提取溶剂，分别超声30、45、60 min，结果超声 45、60 min 均较 30 min提取完全，但两者差异较小。故确定70%甲醇超声提取45 min作为供试品制备方法，既简便可靠，又不会造成有效成分的破坏。

3.3 检测波长的选择:利用二极管阵列紫外检测器检测，将对照品溶液在200～500 nm进行在外扫描，结果表明，3个苯乙醇苷成分在330 nm波长下均有较大吸收，故选择330 nm作为检测波长。

3.4 实验结果表明，在不同产地螃蟹甲药材和1个螃蟹甲制剂中均检测到3个苯乙醇苷类成分的存在，总体看来，毛蕊花糖苷＞isoacteoside＞异毛蕊花糖苷。但是，这种含量差异与其中的环烯醚萜苷类成分一样没有明显的规律性［5］。考虑到螃蟹甲药材采集困难，样本量较少，其普遍性还有待进一步研究。苯乙醇苷和环烯醚萜苷类成分在螃蟹甲药材中含量很大，很可能为螃蟹甲中的活性成分。因此，建议在建立螃蟹甲药材及其制剂质量标准的同时应测定苯乙醇苷和环烯醚萜苷类成分。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(65卷第二分册)［M］.北京:化学工业出版社，1995:126，231.

［2］赵 斌，董小萍，吴健明.HPLC法测定螃蟹甲中山栀苷甲酯的含量［J］.药物分析杂志，2009，29(2):323.

［3］张军莉，徐 娟，李茂星.HPLC法测定了藏药螃蟹甲中8-乙酰氧基山栀子苷甲酯的含量［J］.解放军药学学报，2009，25(3):261.

［4］靖 会，佐建锋，李教社.苯乙醇苷类化合物的药理研究进展［J］.时珍国医国药，2006，17(3):440.

［5］许敬英，苏 奎，周 静.苯丙素苷类化合物的研究进展(Ⅱ)［J］.时珍国医国药，2007，18(7):1770.