铜绿假单胞菌生物被膜诱导肺泡上皮细胞分泌炎性细胞因子的研究

王 非 王 媛 赵 玮 骆仙芳 浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）是引起多脏器医院感染的常见病原菌之一，能形成生物被膜，易在慢性支气管炎、支气管扩张等原有肺部慢性病变基础上引起肺部反复感染并纤维化[1]。有证据显示，铜绿假单胞菌生物被膜可能是引起该菌感染引起肺纤维的化主要因素[2-3]。然而，铜绿假单胞菌生物被膜如何诱导肺纤维化机制不明。我们采用铜绿假单胞菌生物被膜作用人肺上皮细胞，检测其分泌炎症细胞因子的情况，探讨铜绿假单胞菌生物被膜在感染性纤维化中作用，以期为阐明铜绿假单胞菌生物被膜诱导的感染性肺纤维化提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及培养 铜绿假单胞菌ATCC27853株购自北京中国药品生物制品检定所。将细菌接种于LB琼脂平板上（Sigma），挑取单个菌落接种至 5mL LB培养液中，37℃、210r/min旋转培养12～16h。取lmL菌液10 000r/min离心 3min，取沉淀用0.01mol/L PBS（pH7.4）洗涤、离心2次。细菌沉淀用 lmL PBS重悬，经麦氏比浊法测定菌液浓度后用PBS配制成5×108CFU/mL菌液。

1.2. 细胞株及培养 人肺上皮细胞株A549购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。上述细胞培养于含10%胎牛血清（FCS，GiBco）、100 U/mL青霉素（Sigma）、100 U/mL链霉素（Sigma）的DMEM（GiBco）培养基中，37℃、5%CO2条件下培养2～3 天传代。

1.3 铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐的纯化 铜绿假单胞菌ATCC27853株接种在LB琼脂平板上，37℃培养7天。刮取培养物悬于PBS中，17 000r/min，4℃离心30min，上清液用花板0.22μm滤膜过滤去除残留菌体，100℃水浴30min使蛋白变性，17 000r/min，4℃离心30min，用80%的乙醇将其中的藻酸盐沉淀。藻酸盐粗提物溶解于含有10mM的……