微流控芯片非接触电导检测法测定溴吡斯的明片中溴吡斯的明的含量Δ

蔡自由，李永冲，陈缵光（.广东食品药品职业学院，广州市50520；2.中山大学药学院，广州市50006）

溴吡斯的明（Pyridostigmine bromide）是一种有效的胆碱酯酶抑制药。文献报道的有关溴吡斯的明片含量测定的方法有紫外-可见分光光度法[1]、高效液相色谱（HPLC）法[2～5]等。紫外-可见分光光度法的选择性相对较低；HPLC法分析成本高、样品处理较烦琐，且流动相多为有毒溶剂。采用微流控芯片分析目前国内、外尚未见报道。笔者采用微流控芯片非接触电导检测法[6]测定溴吡斯的明片中溴吡斯的明的含量，与传统方法相比具有简便快速、样品前处理简单、重复性好的特点，为其检测提供了一种比较方便、准确、有效的新方法。

1 仪器与试药

PMMA十字通道芯片（大连理工大学微系统研究中心，微通道上宽30 μm，下宽100 μm，深30 μm，进样通道为十字结构，分离通道长44 mm，有效分离长度43 mm）；微型压电陶瓷高压电源（自制）[7]；非接触电导检测器（自制）[6]；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩仪市英峪予华仪器厂）；色谱工作站（中山大学医药仪器与应用研究所），数据记录与处理在普通P4微机上完成。

溴吡斯的明对照品（海南凯健制药有限公司，纯度＞99.99%）；溴吡斯的明片（上海中西三维制药有限公司，批号：20090606、20101004、20101005、20101006，规格：60 mg）；2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（香港AMRES公司）；三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（Farca Chemical Supplies，优级纯）；水为二次蒸馏水，其他试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 试验条件

缓冲体系：1 mmol·L－1HAc+1 mmol·L－1NaAc（pH 4.5）；分离电压：1.80 kV；进样时间：10.0 s；不加添加剂；非接触电导检测器激发电压：60 V（Vp-p），频率：60 kHz。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 准确称取溴吡斯的明对照品0.010 0 g，用二次蒸馏水溶解并定容于10 mL容量瓶中，得1.00 mg·mL－1溴吡斯的明对照品溶液，4℃下保存，临用时稀释成各浓度的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取溴吡斯的明片20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于溴吡斯的明0.012 g），置于200 mL容量瓶中，加水约100 mL，充分振摇使溴吡斯的明溶解，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，得溴吡斯的明片供试品溶液。

2.3 线性关系考察和检出限

制备浓度为 1.0～200 μg·mL－1的系列对照品溶液，按“2.1”项下试验条件测定。以溴吡斯的明峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，μg·mL－1）为横坐标，得线性方程Y＝1 887.8X－1 241.3（r＝0.999 7）。结果表明，溴吡斯的明质量检测浓度在10～100 μg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系，检出限为0.6 μg·mL－1（S/N＝3）。

2.4 精密度试验

准确吸取1.00 mg·mL－1溴吡斯的明对照品溶液5.00 mL，加水稀释100 倍，得50 μg·mL－1溴吡斯的明对照品溶液，重复进样6次，按“2.1”项下试验条件测定。结果，溴吡斯的明峰面积的RSD＝1.9%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

按“2.2.2”项下方法制备溴吡斯的明供试品（批号：20090606）溶液，4 ℃下保存，按“2.1”项下试验条件，分别于0、2、4、6、8 h进样测定。结果，溴吡斯的明峰面积RSD＝2.0%，表明测定液在4℃下放置8 h内稳定。

2.6 加样回收率试验

精密量取溴吡斯的明片供试品（批号：20101005）溶液（59.5 μg·mL－1）5.00 mL 3份，分置于10 mL容量瓶中，分别按供试品含量的80%、100%、120%加入溴吡斯的明对照品溶液（1.00 mg·mL－1）238、298、358 μL，加水稀释并定容至10.0 mL，分别进样3次，测定结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝3）Tab 1 Results of content determination of PBT samples（n＝3）

2.7 样品含量测定

取溴吡斯的明供试品（批号：20090606）溶液和对照品溶液适量，分别进样，记录电泳图（见图1）。结果，电泳谱图基本一致，说明供试品辅料不出峰，对本法测定溴吡斯的明不干扰，故未设阴性对照。

图1 芯片毛细管电泳谱图Fig 1 Capillary electrophotogram of microfluidic chip

取3批供试品（批号：20101004，20101005，20101006）溶液适量，分别进样，记录电泳图，根据“2.3”项下线性方程计算出溴吡斯的明片含溴吡斯的明（C9H13BrN2O2）的标示量，结果见表2。

表2 溴吡斯的明片样品含量测定结果Tab 2 Results of recovery test

3 讨论

3.1 缓冲溶液

笔者考察了不同缓冲体系对溴吡斯的明分离检测的影响。结果发现，在MES-Tris、Tris-HC1、Tris-HAc、Tris-H3BO3、柠檬酸-柠檬酸钠、三乙胺-H3PO4等缓冲溶液中，溴吡斯的明不出峰，其原因可能是上述各种缓冲液的电导与样品的电导相差不大导致；在MES-His、Tris-His等缓冲溶液中出峰高，但与水峰或杂峰相连；在二乙胺-H3PO4、NaH2PO4-Na2HPO4等缓冲体系中出峰高，但峰形不好，且与杂峰相连；在三乙胺-H3BO3、HAc-NaAc、二乙胺-H3BO3、硼砂-H3BO3等缓冲体系中出峰高，且峰形和分离度都较好。综合考虑峰形、峰高、分离度、基线和噪声等因素，选择了HAc-NaAc缓冲体系，如图2所示。

图2 溴吡斯的明在不同缓冲溶液中的芯片毛细管电泳谱图Fig 2 Capillary electrophotogram of PB in different buffer solutions

试验还考察了HAc和NaAc浓度和配比的影响。结果发现，随着总体浓度的增大，电流也随着增大，焦耳热效应使基线噪声也随之增加；HAc和NaAc配比不同，缓冲体系pH会影响溴吡斯的明出峰的峰形和峰高。在c（HAc）∶c（NaAc）＝1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、2∶2、2∶3、2∶4、3∶1、3∶2、3∶3、3∶4、4∶1、4∶2、3∶4和4∶4 mmol·L－1的缓冲体系中，都能实现溴吡斯的明分离。综合考虑峰形、峰高、分离度、基线和噪声等因素，优化选择1 mmol·L－1HAc+1 mmol·L－1NaAc（pH 4.5）作为缓冲体系。

3.2 添加剂

考察了不同种类的添加剂，如甲醇、乙醇、十二烷基硫酸钠（SDS）、β-环糊精（β-CD）等不同加入量对分离检测（噪声、拖尾因子、灵敏度和分离度）的影响。结果发现，加入0.1～0.5 mmol·L－1SDS对灵敏度有提高，但迁移时间明显缩短，样品峰与杂峰相连，随着其浓度的增加，离子强度增大，电渗流亦增大，迁移时间变得更小，而且噪声随之增大，基线漂移亦随之明显。加入体积分数1～10%甲醇和1～10%乙醇，迁移时间随体积分数增加而增大，检测灵敏度随之降低。加入β-CD 0.1～1.0 mmol·L－1对分离检测无改善。综合分离检测效果，优化选择不加添加剂。

3.3 分离电压

试验考察了分离电压（1.00 kV～3.00 kV）对分离和检测的影响。结果发现，随着分离电压的升高，样品出峰时间缩短，电流增大，噪声也增大。升高分离电压，迁移时间明显缩短，有利于加快分析速度，但样品峰逐渐与杂峰相连，分离度变差，不利于分离；同时，电流增大，焦耳热亦增大，会导致噪声大幅度增加。综合考虑分离度、峰形、噪声等因素，优化选择分离电压为1.80 kV。

3.4 进样时间

在其他因素相同的条件下，考察了进样时间对分离和检测的影响。结果表明，进样时间在5.0 s～20.0 s范围，当进样时间延长时，峰高与峰面积呈增大趋势。但当进样时间超过15.0 s后，峰高增加的幅度减少，分离效果变差，而且随着进样时间的增加，一些不利因素如峰展宽和峰形拖尾等影响变得显著。综合考虑，优化的进样时间为10.0 s。

综上所述，微流控芯片非接触电导检测法测定溴吡斯的明片中溴吡斯的明的含量，方法简便快速，重复性好，可用于溴吡斯的明片的质量控制。

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：820.

[2] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：1 090.

[3] 王丽君，王东凯，黎 玲，等.溴吡斯的明注射液的制备及其含量测定[J].中国新药杂志，2007，16（11）：881.

[4] 付文焕，施孝金，李中东，等.人血浆中溴吡斯的明浓度的RP-HPLC测定法[J].中国药学杂志，2007，42（12）：924.

[5] 张大富.反相离子对色谱法测定溴吡斯的明的血药浓度及生物等效性研究[J].中南药学，2009，7（4）：285.

[6] Chen Zuanguang，Li Quanwen，Li Oulian，et al.A thin cover glass chip for contactless conductivity detection in microchip capillary electrophoresis[J].Talanta，2007，71（5）：1 944.

[7] 陈缵光，王立世，莫金垣.微全分析系统专用微型电源的研制[J].高等学校化学学报，2004，25（增刊）：26.