蛋白连接组织生长因子表达腺病毒的构建及其基因功能

宫 宁,章华兵,方福德,常永生

中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京 100005

蛋白连接组织生长因子 (connective tissue growth factor,CTGF),是一个相对分子质量为36000～38000的富含半胱氨酸的肝素结合蛋白,一个高度保守的CCN家族成员,CCN是由这个家族3个主要成员CTGF、富含半胱氨酸-61(Cysteine-rich 61,Cyr-61)、肾胚细胞瘤过表达基因 (nephroblastoma overexpressed gene,Nov)的英文首字母衍生出来的缩写[1]。研究表明,在肾小球系膜上CCN2能够激活Wnt途径[2]。体外研究发现,CTGF在几种细胞中都能被转化生长因子 -β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)所诱导,包括人的真皮细胞[3]。在体外TGF-β1能够高亲和力结合到3T3-L1细胞的原生质膜上,并且能够抑制脂肪细胞的转化[4]。在纤维化症中,CTGF是 TGF-β1下游的介质[5]。糖尿病型心肌病被定性为间质纤维化、心肌肥大和细胞凋亡,而CTGF参与纤维化过程[6]。在链唑霉素诱导的糖尿病肾病大鼠中,CTGF表达量上升。高浓度葡萄糖能够刺激TGF-β1表达,而肾小球系膜细胞的TGF-β1引发了 CTGF的表达。高糖诱导的CTGF表达能够被抗TGF-β1抗体和蛋白激酶C抑制剂GF109203X所抑制[7]。在糖尿病小鼠心肌细胞中CTGF表达量升高[8]。到目前为止,CTGF在糖脂代谢方面的作用研究比较少,功能尚不清楚。对CTGF基因的深入研究将有望成为肥胖、糖尿病、脂肪肝等代谢疾病的治疗靶点。本研究构建及鉴定了CTGF基因过表达腺病毒,初步探究了CTGF在糖脂代谢方面的功能。

材料和方法

材料 CTGF扩增序列引物 (美国Invitrogen公司),扩增序列:5′-CTGCTGTGCATCCTCCTACC-3′(正向),5′-AATGAGTTCGTGTCCCTTACTTC-3 ′(反向);两端分别添加Kpn I和Xba I酶切位点,C端加Flag标签。Kpn I和Xba I酶、T4 DNA连接酶、pyrobest Taq DNA聚合酶、dNTP(日本Takara公司),T-easy质粒、实时定量 PCR试剂盒 (美国……