ABCE1基因siRNA稳定转染小细胞肺癌细胞株阳性克隆的筛选

黄波，王晓东，郎贤平

（辽宁医学院附属第一医院胸外科，辽宁 锦州 121000）

小细胞肺癌是恶性度极高的肿瘤，早期即发生淋巴及血行转移是其重要的临床特点。小细胞肺癌的转移是多基因参与的复杂过程［1］。研究资料表明，ABCE1蛋白能够阻断干扰素介导的2-5A/核糖核酸酶L细胞抗病毒通路，并诱导前列腺癌的发生与转移，参与结肠癌的原始免疫应答［2］，但ABCE1基因与肺癌及其转移的相关报道较为罕见。因此我们构建了含有新霉素Neo基因（可用G418筛选）且带有绿色荧光的ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA表达载体，并将其转染入小细胞肺癌细胞，筛选出稳定转染ABCE1-siRNA的小细胞肺癌细胞株，为进一步研究ABCE1基因在小细胞肺癌中的作用打下实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人小细胞肺癌细胞株NCI-H446由中国科学院细胞库引进。新生小牛血清购于杭州四季青公司，RPMI-1640培养基和FUGENE HD购于美国Gibco公司。菌株E.coliDH5α购于上海闪晶生物公司。pRNAT-U6.1/Neo购于上海闪晶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA载体构建：将合成的引物退火，95℃10 min后自然冷却。将pRNA-U6.1/Neo载体用BamHI/HindⅢ双酶切。使用DNA Ligation Kit将退火产物与pRNAT-U6.1/Neo载体4℃过夜连接。热转化至E.coliDH5α中，分别命 名 为 ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1，ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2，ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-N，涂布平板后，37℃培养过夜。从转化平板上挑取白色阳性单菌落，提取质粒并测序。

1.2.2 G418浓度的确定：将对数生长期的NCIH446细胞用胰酶消化，以3×105个/孔接种于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。铺板第 2 日加入不同浓度的 G418（50、100、200、300、400、500 μg/ml），每 3 d 换液 1 次，换液同时加入G418，共培养3周。

1.2.3 细胞转染及阳性克隆的筛选：转染前1 d，NCI-H446细胞用胰酶消化，接种于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，当细胞达到70%～80%融合时，准备转染。……