阿霉素－槲皮素复方脂质体的制备

陈浩，王玉蓉，孙毅坤，周洪伟，黄秀荣，戴俊东

(北京中医药大学，北京 100102)

多药耐药(MDR)［1］仍然是肿瘤治疗的主要挑战，固有和获得的MDR可在多种肿瘤中发生，尤其是广谱抗癌药的代表阿霉素(Doxorubicin，DOX)，MDR是导致其癌症治疗失效的主要原因。目前较常用的抗耐药方法是使用耐药逆转剂，近来研究表明，槲皮素(Quercetin，QUE)不但能抑制多种肿瘤细胞的增殖，还能调节CYP3A4及P－糖蛋白表达逆转MDR的活性［1－4］，但 QUE 水 溶 性 差，在 水 中 溶 解 度 仅 为0.047mg/mL［5］，要发挥疗效往往需要应用一定的制剂技术来增溶以提高其生物利用度。脂质体作为抗肿瘤药物的优良载体，既能提高QUE的溶解度，又能靶向肿瘤细胞以降低DOX的心脏毒性［6］，故制备DOXQUE复方脂质体(DQ－Lip)，两药合用的同时利用脂质体的渗透滞留增强效应(EPR)［7］靶向于肿瘤部位，降低肿瘤细胞的MDR，提高疗效。

1 材料与仪器

槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院，批号100081－200406，纯度:97.3%);槲皮素(四川协力有限公司，批号090503);盐酸阿霉素(北京华丰科技有限公司，批号HF090516);氢化大豆磷脂SPC－3(Lipoid);胆固醇(Sigma);除高效液相分析所用试剂为色谱纯外;其它试剂均为分析纯;核迹聚碳酸酯微孔滤膜(英国Waters公司)。

RE－52CS型旋转蒸发仪(上海亚荣);SCIENTZ－IID型超声波细胞粉碎仪(浙江新芝);NANO－CS型动态光散射粒径仪(美国马尔文);JEM－1230型透射电镜(日本JEOL);TU－1810APC型紫外可见分光光度计(北京普析通用);SPD－20A型高效液相色谱仪(日本岛津);DL－5－B型离心机(上海安亭);XL－90型超速离心机(美国BeckMan)。

2 方法与结果

2.1 脂质体的制备 采用硫酸铵梯度法［8］制备DQ－Lip:取处方量氢化大豆磷脂、胆固醇、槲皮素(HSPC∶CH=3∶1mol/mol、HSPC∶QUE=20∶1mol/mol)，溶于9mL无水乙醇中，置于250mL梨形瓶内，40℃水浴减压旋转蒸发除去无水乙醇，形成均匀透明薄膜，加入0.15mol/L硫酸铵溶液10mL，75℃水浴常压旋转水化30min，使磷脂充分溶胀水合。所得淡黄色混悬液经探头超声(600W)9min，再依次经0.8μm、0.4μm核迹聚碳酸酯膜挤出各5次整粒，即得淡黄色的槲皮素脂质体(QUE－Lip)［9］。放置过夜后置于透析袋(分子量8 000～14 000M)中，放入300mL生理盐水，冰水浴下560rpm磁力搅拌10h，每40min更换1次生理盐水，充分形成硫酸铵梯度;再与2mg/mL的DOX 溶液 1∶1(v/v)混合(DOX:HSPC=1∶7.9w/w)，55℃水浴孵育25min，取出后冰水浴冷却，即得DQLip。

2.2 脂质体包封率测定 采用超速离心法测定脂质体中DOX与QUE的包封率。精密量取DQ－Lip溶液0.1mL，置于5mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀;取适量至离心管内，以200 000g保持4℃恒温超速离心2h，精密量取上清液1mL，置于5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45μm滤膜过滤后进样15μl，HPLC法测定其中 DOX、QUE 的含量 W1。另精密量取DQ－Lip溶液0.1mL，直接用甲醇溶解并稀释至25mL，依法测定其中DOX、QUE的总含量W2。

RP－HPLC色谱条件:色谱柱:Kromasil C－18柱(4.6 ×250mm，5μm);流动相:甲醇:乙腈:PBS(pH 3.8)=19∶29∶52;流速:1.0mL/min;柱温:25℃;检测波长:254nm。

2.3 脂质体粒度分布测定 采用马尔文动态光散射粒径仪检测平均粒径(A－Size)和多分散系数(PDI)。激光束波长633nm，入射与散射光束夹角173°，温度25℃。取100μL脂质体溶液用水稀释至1.5mL，摇匀平衡3min后测定。

2.4 脂质体形态学考察 采用负染透射电镜观察。将样品稀释至适当浓度后，滴于300目铜网表面，5min后用滤纸吸去多余液体，加入1滴2%磷钨酸溶液(pH 7.0)染色5min，滤纸吸去多余液体，自然晾干后测定。

2.5 脂质体制备工艺研究

2.5.1 孵育包封DOX对脂质体粒径及QUE包封率的影响 取QUE－Lip，65℃水浴孵育包封DOX制备DQ－Lip。取包封DOX前后的样品照2.3项下方法测定粒度分布，结果如图1所示:平均粒径从174.8nm降低至 151.8nm，PDI从 0.622 降低至 0.383，表明加热孵育DOX对脂质体的粒度无负影响。取包封DOX前后的样品照2.2.4项下方法操作，测定QUE的包封率。结果表明，包封DOX后QUE的包封率从94.7%下降至80.7%，说明孵育加热会造成已包封于磷脂双分子层内的部分QUE泄漏，从而降低QUE的包封率。

2.5.2 孵育温度对DOX包封率的影响 将形成硫酸铵梯度的QUE－Lip与2mg/mL阿霉素溶液1:1 v/v混合(DOX∶HSPC=2∶7.9w/w)，分别于 45℃、55℃、65℃水浴条件下孵育25min，取出后冰水浴冷却，考察孵育温度对脂质体包封率的影响，实验结果见表1。结果表明，在55℃水浴条件下孵育DOX的包封率最高。

表1 包封温度对DOX包封率的影响 (n=3)

2.5.3 药脂比与硫酸铵浓度对DOX包封率的影响

分别采用不同药脂比的QUE(QUE∶HSPC=1∶15、1∶20mol/mol)和硫酸铵梯度(浓度为 0.15mol/L、0.25mol/L)制备QUE－Lip;然后于55℃水浴孵育包封不同药脂比的 DOX(DOX:HSPC=1∶7.9、2∶7.9w/w)制备DQ－Lip，考察各因素对DOX包封率的影响。结果表明(表2)，随脂质体中QUE和DOX药脂比的增加，DOX的包封率下降;而增大硫酸铵梯度有助于提高DOX的包封率。

图1 包封DOX对脂质体粒径的影响

表2 药脂比与硫酸铵梯度对DOX包封率的影响 (n=3)

2.5.4 DQ－Lip制备工艺验证 选择QUE药脂比为1:20mol/mol、水化硫酸铵浓度为0.15mol/L，55℃水浴孵育包封DOX(药脂比1:7.9w/w)，重复制备3批DQ－Lip。经检测，DOX与QUE的包封率分别为(90.6±0.61)% 和(83.3 ± 0.24)%，RSD 分别为 0.29% 和0.68%(n=3);DQ－Lip的平均粒径为138.5nm，PDI为 0.264，分布均匀，粒度圆整(图2、图3)。

3 讨论

硫酸铵梯度法制备脂质体中，脱盐形成硫酸铵梯度的方法主要为葡聚糖凝胶柱层析法(包含微柱离心法)和透析法。对于凝胶柱层析法而言，实验发现，QUE会与葡聚糖凝胶G－50强烈吸附，采用水、生理盐水、PBS缓冲液等方法均难以洗脱;同时柱层析法在一定程度上会造成脂质体的稀释，不利于DQ－Lip的制备。透析法虽然耗时较长，但操作简便，能在不稀释脂质体的前提下充分脱盐，在脂质体膜内外形成足够的硫酸铵梯度，从而保证DOX的高包封，因而本文采用透析法制备DQ－Lip。

图2 DQ－Lip粒度分布结果

脂质体中药物包封率是其质量评价的重要指标，测定方法需根据实验的具体情况进行选择。其常用的测定方法包括透析法、葡聚糖凝胶柱层析法、鱼精蛋白沉淀法和高速离心法。其中，透析法所需样品量大，持续时间长，主要用于水溶性药物的测定，对QUE等疏水性药物不适用;QUE会与G－50强烈吸附，故凝胶柱层析法也不适于本实验;鱼精蛋白沉淀法主要用于负电荷脂质体和中性脂质体中药物包封率的测定［10］，实验结果表明，DOX电离后形成的阳离子会吸附于DQ－Lip表面，降低带正电荷的鱼精蛋白对脂质体的絮凝作用，使脂质体沉淀不完全，以致药物包封率测定结果偏低。综上，本实验最终确定以经典的高速离心法测定DQ－Lip中DOX与QUE的包封率，结果表明此法可行，所得结果准确。

图3 DQ－Lip透射电镜照片

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