山东地产药材桔梗的HPLC指纹图谱研究

宋健，王颖，石俊英*

（山东中医药大学药学院，山东 济南 250 355）

山东地产药材桔梗的HPLC指纹图谱研究

宋健，王颖，石俊英*

（山东中医药大学药学院，山东 济南 250 355）

目的：采用R P-HPL C对桔梗指纹图谱进行方法学研究，建立桔梗药材HPL C指纹图谱。方法采用梯度洗脱方法进行色谱分离，测定10批药材并记录指纹图谱，不同样品的相似度采用国家药典委员会制度的中药色谱指纹图谱相似度软件计算。结果：在选定的色谱条件下标定出16个峰为桔梗指纹图谱的共有峰。结论：该方法精密度高，重现性好，可为桔梗HPLC指纹图谱提供依据。

桔梗；HPLC；指纹图谱

桔梗来源于桔梗科植物桔梗Platy codon grandiflo rum（Jacq.）A.DC.的干燥根，性味苦、辛、平，归肺经。具有宣肺，利咽，祛痰，排脓的功能。用于咳嗽痰多，胸闷不畅，咽痛音哑，肺痈吐脓［1］。桔梗药材中含有皂苷类、多糖、脂肪酸、氨基酸等多种成分，其中皂苷类是主要的药理活性成分。目前国内外对桔梗的研究主要集中在化学成分及药理作用的研究［2-5］，缺乏综合评价和分析药材质量的方法。中药指纹图谱作为现代中药质量控制和鉴别的新兴技术，可全面反映中药复杂的化学成分及其相对比例，在大多数中药化学成分尚未阐明的现状下，仍可有效表征中药质量。本实验采用R P-HPLC方法，首次对桔梗主要成分进行指纹图谱研究，以期解决桔梗质量评价关键问题，为桔梗的综合质量控制提供参考。

1 仪器与材料

AGILENT1100高效液相色谱仪；AGILENTCH EMSTATION工作站；AGIL ENT DAD检测器。桔梗皂苷D（PlatycodinD）对照品（吉林农业大学郑毅男教授提供，纯度＞98%。乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸为分析纯，水为超纯水。

桔梗药材来源见表1，样品经石俊英教授鉴定为桔梗科植物桔梗Platy codongr and if lorum（Jacq.）A.DC.的干燥根。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈－水－2%磷酸梯度洗脱模式见表2；柱温：30℃；流速：1.0m L·min－1；检测波长：210nm；进样量：10μL。

表110 批桔梗药材来源及采收日期

表2 流动相线性梯度表

2.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的桔梗皂苷D对照品，加甲醇溶解，配成0.4m g·m L－1，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取桔梗粉末4g，加入甲醇30m L，浸泡过夜，超声提取30min，过滤，浓缩，定容至5m L容量瓶中，0.45μm微孔滤膜过滤。

2.4 精密度试验

取同一供试品溶液于高效液相色谱仪连续进样5次，记录色谱图。对色谱图中主要峰进行了保留时间和峰面积的精密度考察，经分析 R S D分别在0.0 4%～0.79%，0.42%～3.0 8%，表明精密度良好。

2.5 重复性试验

取同批次桔梗药材5份，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别进样，记录色谱图。对色谱图中主要峰进行了保留时间和峰面积的重复性考察，经分析R S D分别在0.0 6%～1.90%，1.96%～3.62%，表明此种提取方法和分析方法重现性良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液分别于0，2，4，8，24h进样，记录色谱图。对色谱图中主要峰进行了保留时间和峰面积的稳定性考察，经分析 R S D分别在0.0 8%～2.44%，1.0 3%～2.96%，表明桔梗主要成分在24h内稳定。

3 结果

3.1 桔梗皂苷D的标定

分别进样对照品与供试品溶液，记录色谱图，见图1。由色谱峰保留时间确定S峰为桔梗皂苷D的色谱峰。

图1 桔梗皂苷D对照品及桔梗样品HPLC图

3.2 图谱测定时间的确定

取供试品溶液10μ L注入高效液相色谱议，记录2h内色谱图，结果表明样品40m i n后无有意义峰出现，故选择记录时间为40m i n。

3.3 指纹图谱的建立与分析

3.3.1 样品指纹图谱测定 取10批桔梗样品按上述提取方法与色谱条件进行分析，记录色谱图，结果见图2。

图210 批桔梗药材HPLC指纹图谱

3.3.2 共有峰的标定 通过对上述10批桔梗样品的测试分析和多次研究比较，利用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，归纳确定山东道地药材桔梗的HPLC指纹图谱具有16个共有的基本特征峰（由于3.5m i n之前的色谱峰分离不好，故将其作为一整体进行分析）。非共有峰面积均小于总峰面积的10%，符合中药材指纹图谱要求。以12号峰（桔梗皂苷D）为参照峰，各共有峰峰号、相对保留时间及相对峰面积见表3。

表3 特征峰峰号、相对保留时间及相对峰面积

3.3.3 相似度计算 利用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，以沂源G A P基地产桔梗为参照，相似度（S）计算结果见表4。

表410 批桔梗样品相似度

4 讨论与小结

4.1 提取方法的选择

实验中以单因素方法筛选了提取溶剂（水、70%乙醇、乙醇、甲醇）、提取方式（直接超声提取、浸泡过夜超声提取、回流提取、索氏提取），经HPLC测试分析，结果表明甲醇浸泡过夜再超声提取制备的供试品溶液最佳，可较多地提取桔梗中主要成分，提取方法简捷、有效。

4.2 流动相的选择

桔梗中所含成分复杂多样，实验中选用等度洗脱难以达到很好的分离，而采用梯度洗脱可以得到较好的分离效果。由于没有文献借鉴，我们考察了大量不同组合、不同比例的流动相，如甲醇－水－磷酸，乙腈－水－磷酸等。结果表明，乙腈－水－磷酸洗脱体系比甲醇－水－磷酸效果好，故选用乙腈－水－磷酸梯度洗脱。

4.3 检测波长的选择

通过从光谱图数据中筛选信号，获得分离色谱峰信息较多的检测波长，再以此波长为指纹图谱的检测波长，进行研究。通过对210，225，245，268nm进行了优选，结果表明在210nm处色谱图所包含的峰数较多、信息量较大、各色谱峰分离较好，灵敏度较高。故选择210nm作为检测波长。

4.4 桔梗指纹图谱研究方法的建立

本实验以山东“道地”药材桔梗为主，以河南、陕西、安徽等地的桔梗作对比，采用HPLC对桔梗主要化学成分指纹图谱进行了研究，标定出16个峰为桔梗指纹图谱的基本峰，确定12号峰为桔梗皂苷D，并将其选为参照峰（S），计算出了共有峰保留时间的比值（Rrt），共有峰峰面积的比值（Ra）和非共有峰峰面积比值等指纹图谱评价标准。初步建立了桔梗指纹图谱的研究方法，考察了10批桔梗的指纹图谱，对其进行了相似度研究。桔梗为大宗常用药材，由于其成分复杂以及化学对照品较少，对桔梗的研究一直处于较低水平，本实验首次采用HPLC完成了对山东地产药材桔梗指纹图谱的研究，为桔梗指纹图谱的建立提供了科学依据。

［1］国家药典委员会.中国药典［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：259-260.

［2］何美莲，程小卫，陈家宽，等.桔梗皂苷类成分及其质量分析［J］.中药新药与临床药理，2005，16（6）：457-460.

［3］徐宝军，郑毅男，崔勐，等.电喷雾串联质谱法鉴定桔梗皂苷D［J］.中国药物化学杂志，2000，10（3）：193.

［4］Lee JY，Yoon JW，Kim CT，et al.Antioxidant activity of phenylpropanoid esters is olated and identified from Platyc-odon grandiflorum A.DC［J］.Phytochemistry，2004，65（22）：30 33-30 39.

［5］Reininger EA，Bauer R.Prostaglandin-H-synthase（PGHS）-1and-2 microtiter assays for the testing of herbal drug sand in vitro inhibiti on of PGHS-isoenzyms by polyunsaturated fatty acids from Platycodi radix［J］.Phytomedicine，2006，13（3）：164-169.

Stud yon Fingerprint of Platycodonis Radix by HPLC

SONGJian，WANGYing，SHIJun-ying
（Shandong University of Tcm，Jinan 250355，China）

Objective：To study the methodology of fingerprint by RP-HPLC in order to establish the fringerprint of Platycodonis Radix.Methods：A gradient mobile system was applied in the experiment.The fingerprints of ten habi-tats were recorded and compared with similarity evaluation software published by committee of codex.Results：Sixteen peaks were identified as the characteristic finger prints of Platycodonis Radix.Conclusion：This method shows high pre-cision and good repeatability，and it can provide the basis for studing the HPLC fingerprint of Platycodonis Radix.

Platy codon is Radix；HPLC；Finger print

山东省重大科技攻关专项（S D S P 2005-0 720-0 6）

*石俊英，E-m a i l：s j y 50 12＠126.c om

2011-0 3-22）