骨髓间充质干细胞抑制Wistar大鼠脊髓损伤区神经元凋亡的实验研究

李东君,贾全章*,陈玉丙,孙景海,吴传真,王风华,徐 爽,刘丽萍,姜大伟,高德萱

(1.解放军第208医院,吉林 长春130062;2.吉林大学附属第二医院,吉林 长春130041)

骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem cells,BMSCs)具有强大的增殖能力和多向分化潜能,在特定的诱导环境条件下可以向骨、心肌、神经元等多胚层方向分化[1-4]。细胞凋亡是脊髓继发性损伤的重要形式之一,受多种凋亡相关蛋白的调控[5]。有研究报道BMSCs移植能改善脊髓损伤大鼠的运动功能[6,7]。本实验探讨BMSCs移植对脊髓损伤大鼠凋亡调控蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2表达。

1 材料

1.1 实验动物与分组 清洁级Wistar大鼠120只,雌性,体重(260±20)g,随机分为4组各30只:对照1、2组,治疗1组、2组。出生5天的Wistar乳鼠(8.0-10.0 g)5只。均购自吉林大学实验动物中心。

1.2 主要仪器与试剂 MC01751IF型CO2培养箱(日本SANYO);FACScan流式细胞仪(美国BD公司);DMEM 培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Hyclone公司);兔抗鼠CD34荧光直标抗体(美国BD公司),激光共聚焦显微镜(日本OLYMPUS公司),浓缩型DAB试剂盒(北京中山)。

1.3 实验方法

1.3.1 BMSCs的提取、分离、培养 Wistar乳鼠5只,颈椎脱臼法处死,无菌下取股骨和胫骨的骨髓细胞,采用贴壁筛选法结合差速贴壁法分离、纯化BMSCs,贴壁培养法进行培养,原代培养后按1∶3比例传代共3代。

1.3.2 BMSCs的鉴定 每次传代后行形态学观察,并测定表面标志物的表达以鉴定细胞。

(1)BMSCs的形态学观察 使用倒置相差显微镜逐日观察原代及传代培养的细胞,记录细胞生长、增殖情况及形态特征。

(2)细胞表面分子表型检测进行FACS检测分析。细胞表面标志MHC-Ⅰ、Ⅱ常规切片(片厚5 μ m),光镜下观察。

1.3.3 脊髓损伤模型的建立 实验组采用改良的Allen's打击法建立脊髓损伤模型,术后常规方法笼内饲养护理。……