酿酒酵母ADH2基因沉默表达载体的构建

林燕环，魏 芳，叶冰莹，张积森，陈由强

(福建师范大学生命科学学院/农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建 福州 350108)

可再生生物能源能够替代不可再生能源，支持可持续发展的能源，具有重大现实意义。目前随着能源危机的加剧，在产业规模方面发展最快的是燃料乙醇[1]。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是乙醇发酵的主要菌种[2]。因此获得乙醇高产菌株是其发展方向。在酿酒酵母中与乙醇代谢相关的乙醇脱氢酶由ADH1－ADH5编码，其中ADH2催化乙醇氧化为乙醛，其他4个编码基因催化乙醛还原成乙醇[3－5]。在发酵培养过程中，当葡萄糖被消耗完后，ADH2开始催化利用乙醇作为碳源[6]。因此，破坏ADH2催化的乙醇分解代谢反应，提高酿酒酵母合成乙醇的能力是可行的。目前主要利用基因敲除技术敲除ADH2基因，一些研究表明ADH2基因敲除突变株遗传稳定性差[2]。本文利用重叠延伸PCR方法，构建了酿酒酵母ADH2基因沉默的表达载体，以期获得高产的乙醇突变株并能克服遗传稳定差的缺点。

1 材料与方法

1.1 菌种及质粒载体

工业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和大肠杆菌DH5α由福建师范大学生命科学学院农业部甘蔗生理遗传开放重点实验室提供。pUG6和表达载体pYES2.0由福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心惠赠。

1.2 酶和主要试剂

高保真酶、rTaq酶、T4DNA连接酶、KpnⅠ和NotⅠ均购于Takara公司。凝胶纯化试剂盒购自Promega公司。PCR引物由上海生工公司合成。DNA测序由TAKARA公司完成。

1.3 引物设计

根据重叠延伸PCR的原理设计引物[7]，合成以下2对引物。(1)P1:5'-CGGGGTACCAGCTACAAAAAGCATACAATCAACT-3'，P2:5'-GCGTACGAAGCTTCAGCTGGCCCTTAACGTTTTCACCCATGCCG-3';(2)F1:5'-CAGCTGAAGCTTCGTACGC-3'，F2:5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3'。

其中P1引物为5'UTR序列前25个碱基……