Na N3诱变“邯7086”后代变异研究及变异系的SSR分析

谢淑芹,张希太,张彦波,肖磊

（邯郸市农业科学院生物技术中心,河北邯郸056001）

利用基因突变改良品种是小麦遗传改良的重要途径之一.化学诱变具有成本低廉、使用方便、诱变作用专一等特点,是一种发展迅速的育种手段,近年来国内外利用化学诱变育成的农作物品种数量明显增加[1].近半个世纪以来,各国学者曾试用了许多化学物质来筛选有效低毒的化学诱变剂,叠氮化钠（NaN3）是为数不多的能应用于植物化学诱变的高效低毒的化学诱变剂之一,叠氮化钠易诱发植物基因的点突变且对人畜无致癌副作用,近年来叠氮化钠在应用于小麦、大麦、水稻等诱变育种方面取得了明显的效果[2-5].为了创造新的小麦品种资源并且探讨叠氮化钠对小麦诱变处理的适宜方法,进行了叠氮化钠诱变小麦“邯7086”的研究.

1 材料与方法

1.1 材料

叠氮化钠为天津南开大学化学试剂厂生产的分析纯产品,“邯7086”种子为本院小麦研究室赠送.

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理 采用磷酸缓冲系统,缓冲液的pH值为3.0；叠氮化钠为0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L 5种浓度处理,每种叠氮化钠浓度处理分为2个,诱变时一个处理用气泵鼓入空气,另一个不鼓入空气.具体操作为：当年的9月下旬,选饱满的“邯7086”种子,每个处理1 000粒,装入小尼龙袋中,封紧口并悬挂记录标签,先将10个种子处理袋在室温下用自来水浸泡10 h,待种子吸足水分胚开始萌动时分别浸入装有各种叠氮化钠浓度处理液的烧杯中,用气泵向相应的烧杯中鼓入空气,在室温下连续处理3 h,取出种子袋用自来水反复冲洗后按不同处理播入试验田中,并调查出苗率.第2年小麦成熟时按不同处理收割脱粒并保存M0代种子.第2年小麦播种时,从各处理的M0代种子中随机选取3 000粒,按处理单穴单粒播种,第3年小麦收割前调查各处理的变异情况,并选择优良单株,以后每年均按株系单穴单粒播种,并逐年淘劣选优直到获得稳定的株系.

1.2.2 颖苞内滴加 叠氮化钠溶液的配制同1.2.1.在小麦的抽穗扬花期,选大部分小花正在扬花的“邯7086”的麦穗作为诱变材料,在扬花后2 h开始整穗,去掉尚未开放的小花,在颖片内剪去羽毛状柱头,立即用微量注射器滴加10～20 μL叠氮化钠溶液于切口处,套袋并挂标签标记.4 h后复滴1次,每个浓度处理50穗.

小麦成熟后按不同处理分别收获脱粒后保存M0代种子.当年的9月底在大田中,将不同处理的M0种子分小区单穴单粒播种,并调查出苗率.第2年小麦成熟收割前调查各处理的变异株率,变异类型等.然后选优良的变异单株,脱粒按株系保存M1代种子.以后每年按株系单穴单粒播种,并逐年选择直到获得稳定的株系.

1.2.3 生长点注射 叠氮化钠溶液的配制同1.2.1.在小麦的起身拔节期,在生长健壮的小麦植株上选择大的分蘖用微量注射器沿着叶鞘扎入到分蘖的生长点部位,注射约20～30 μL叠氮化钠溶液到生长点部位,将注射后的分蘖挂标签记录.随后的逐年选择过程同1.2.2.

1.2.4 穗茎注射 叠氮化钠溶液的配制同1.2.1.在小麦抽穗期,选择尚未扬花的“邯7086”麦穗作为诱变材料,用微量注射器将不同浓度的叠氮化钠溶液注射到穗茎的腔内,每茎约注射30～50 μL,每个浓度处理50穗.随后的逐年选择过程同1.2.2.

1.3 稳定变异株系的SSR分子标记检测

1.3.1 模板DNA的提取 采用SDS法并参照文献[6]的方法从样品小麦暗培养的黄花麦芽中提取DNA,纯化后取少量的样品溶于无菌的超纯水中制成浓度约为20 ng/μL的模板液.

1.3.2 PCR反应体系的构建与引物的选择 根据Roder发表[7-8]的SSR引物,随机选取分布于各对染色体上的SSR引物45对,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.PCR反应采用25 μL体系,其中TaqDNA 聚合酶 5U（0.2 μL）,DNA 模板液 0.5 μL,上下游引物各 1 μL,25 mmol/L MgCl22 μL,2.5 mmol dNTP 1 μL,10×buffer 2.5μL,无菌超纯水16.8 μL,矿物油15 μL.PCR反应在英国TECHNE公司生产的TC-5000PCR仪上进行,反应程序为：94℃预变性5 min,94℃变性50 s,50℃退火50 s,72℃延伸1 min,30个循环；72℃后延伸5 min,4℃保存.

1.3.3 扩增产物的检测 扩增产物采用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,每泳道上样量为8 μL,在200 V恒电压下电泳2.5 h,剥胶,银染,照相,进行扩增条带的分析.

2 试验结果与分析

2.1 不同叠氮化钠浓度、不同诱变处理方法对M 0代种子发芽率的影响

表1 各种处理M0代种子发芽率

表1数据显示,叠氮化钠溶液诱变的小麦种子,随着叠氮化钠浓度的提高,对种子的生理损伤加大,M0代种子的发芽率迅速下降.种子诱变处理时用气泵鼓入空气的处理,M0代种子的发芽率明显高于不鼓入空气的处理,这是因为不鼓入空气处理的小麦种胚除受到诱变剂叠氮化钠的损伤外,还受到了无氧呼吸带来的伤害,尽管无氧呼吸的损伤在0 mmol/L浓度叠氮化钠处理时表现不明显,但在含有叠氮化钠的各处理中却表现十分明显,使处理种子的发芽率明显降低.据田间调查,用叠氮化钠溶液诱变处理的小麦种子,大田播种后出苗明显推迟,长出的麦苗明显细弱,生长发育缓慢,部分弱苗在越冬时死亡.

由表1可知,用颖苞内滴加、生长点注射和穗茎注射这3种方法诱变处理的M0代种子的发芽率几乎不受叠氮化钠的影响,其原因可能是在种子发育的早期,受叠氮化钠毒害严重的子房、合子、早期的胚胎都未能发育成种子而夭折,受诱变剂损伤较轻或未受损伤的子房、合子、早期的胚胎才发育成了健康的种子,所以它们的M0代种子的发芽率几乎都为100%,颖苞内滴加、生长点注射、穗茎注射3种诱变方法处理的“邯7086”M0代种子,播种后出苗、生长发育都很正常.

2.2 不同叠氮化钠浓度、不同诱变处理方法对M 1代种子变异率的影响

表2 各种处理M1代群体变异率

由表2可见,叠氮化钠诱变种子的处理M1代群体植株的变异率明显高于颖苞内滴加、生长点注射、穗茎注射3种方法.且随着叠氮化钠浓度的提高M1代群体的变异率也提高.种子诱变处理时用气泵鼓入空气的处理,M1代群体的变异率明显高于不鼓入空气的处理,且不鼓入空气的处理M1代群体随叠氮化钠浓度增加变异率提高幅度减小.分析原因,种子诱变时鼓入空气处理的小麦种子受无氧呼吸的损伤较小,有较多的受叠氮化钠损伤较严重的种子得以存活,而在不鼓入空气的处理中无氧呼吸和诱变剂叠同时对种子造成损伤,使得受叠氮化钠损伤较严重的种子不能存活,因此鼓入空气处理的M1代群体变异率高于不鼓入空气的处理.

颖苞内滴加和生长点注射两种诱变方法,当叠氮化钠浓度较低（0.5 mmol/L）时没有诱变效果,只有叠氮化钠浓度大于1 mmol/L时,M1代群体中才出现少量的变异,且变异率随叠氮化钠浓度的提高增幅不大.分析原因,在颖苞内滴加诱变时,由于叠氮化钠溶液中的-N3-1需要通过极细的花粉管才能到达胚囊中影响合子或早期的胚胎细胞,由于花粉管内径的限制尽管提高了滴加的叠氮化钠浓度,可是能到达胚囊中的叠氮化钠溶液的量是有限的,所以其诱变率较低,M1代群体的诱变率随叠氮化钠浓度提高变化不大；生长点注射诱变时,虽然叠氮化钠溶液直接注射到了生长点部位但注入的量较少,生长点部位被诱变的细胞也较少,这些被诱变的细胞在分化过程中又只有很少一部分形成生殖细胞,所以其M1代群体变异率很低.

穗茎注射叠氮化钠溶液的诱变方法,没有效果.这从叠氮化钠诱变植物的原理中不难得到解释,叠氮化钠本身没有诱变作用,它的诱变作用是在植物细胞内通过半胱氨酸合成酶代谢产生的,半胱氨酸合成酶能利用叠氮化钠溶液中的-N3-1合成β-叠氮丙氨酸,而β-叠氮丙氨酸才能作用于细胞的基因组DNA使其发生变异.穗茎注射时叠氮化钠接触的是穗茎部位的细胞,没有接触穗部的生殖细胞,所以在其后代中没有变异产生.

2.3 不同叠氮化钠浓度、不同诱变处理方法的M1代群体变异类型

表3 各种处理M1代群体变异类型

表3显示,种子处理（Ⅰ、Ⅱ）的M1代群体变异类型丰富,和对照相比主要性状变异表现在株高、叶片蜡质层的有无、芒的有无、穗型的改变、成熟期长短、同时还出现了不能成活的叶绿素缺失的白化与黄化株以及不能正常繁殖后代的不育株；颖苞内滴加、生长点注射（Ⅲ、Ⅳ）两种诱变方法处理的M1代群体变异率低,变异类型不丰富,仅出现了矮杆植株、叶片无蜡质层植株、不育株、和叶绿素缺失株.

从M1代开始对变异群体淘劣优选优,从M3代已经开始有稳定的变异系出现.经过多代的选择我们已经从叠氮化钠诱变“邯7086”的变异系统中选出多个各具特色的稳定种质系,其中Ym fl-23、Ym fl-42、Ymfl-46综合农艺性状好,品比产量超对照.为了从分子水平上说明叠氮化钠对“邯7086”的诱变效果,对“邯7086”、Ymfl-23、Ymfl-42、Ymfl-46进行了SSR分子标记检测.

2.4 叠氮化钠诱变“邯7086”变异种质系的SSR分子标记检测结果

SSR分析采用的引物为：xgwm4、xgwm5、xgwm6、xgwm43、xgwm44、xgwm46、xgwm52、xgwm107、xgwm120、xgwm135、xgwm140、xgwm148、xgwm155、xgwm160、xgwm179、xgwm194、xgwm213、xgwm219、xgwm257、xgwm260、xgwm261、xgwm268、xgwm272、xgwm293、xgwm294、xgwm295、xgwm297、xgwm301、xgwm304、xgwm311、xgwm328、Xgwm334、Xgwm339、xgwm357、xgwm400、xgwm408、xgwm428、xgwm437、xgwm469、xgwm493、xgwm499、xgwm614、xgwm617、xgwm642、xgwm645.其中 xgwm148（图1）、xgwm304（图2）、xgwm645（图3）检测出了和“邯7086”不同的多态性DNA片段.

图1 引物xgwm148检测结果

图2 引物xgwm304检测结果

图3 引物xgwm645检测结果

3 小结与讨论

（1）叠氮化钠是一种高效且对哺乳类动物无毒害作用的植物化学诱变剂,本试验结果表明,叠氮化钠对小麦有较强的诱变效应,能够使小麦在株高、蜡质层、芒型、穗型、叶绿素、育性、生育期等方面发生性状变异.在0～2.0 mmol/L浓度范围内随着叠氮化钠浓度的提高对小麦的诱变效应增强.

（2）在本试验采用的诱变处理方法中,用pH值3.0的叠氮化钠溶液处理种子并同时鼓入空气的处理方法处理后种子出苗率高,后代性状变异类型丰富,变异率高,是适合小麦诱变处理的一种切实可行的好方法.

（3）通过SSR分子标记技术检测“邯7086”、Ymfl-23、Ymfl-42、Ymfl-46的基因组DNA,从分子水平上证明了叠氮化钠对小麦的诱变效果.

（4）利用叠氮化钠进行化学诱变的方法是创造小麦新种质、选育小麦新品种的有效途径之一,在扩大遗传变异、加速提高育种效率、改进育种方法方面有着很大发展潜力.

[1]王琳清,陈秀兰,柳学余.小麦突变育种学[M].北京：中国农业科学技术出版社,2004：35-88.

[2]李社荣,王琳清,施巾帼.叠氮化钠处理预辐照冬小麦适宜方法的研究[J].核农学报1991,5（2）：65-71.

[3]张超美.叠氮化钠对小麦的诱变效应[J].湖北农学院学报,1994,14（3）：96-60．

[4]曹欣,杨煜峰,钱强华.叠氮化钠对不同大麦品种的诱变效应[J].浙江农业学报,1991,3（3）：143-146.

[5]彭绍民.叠氮化钠诱变水稻生物学效应研究[J].湖北省作物学会会刊,1987（1）：21-23.

[6]王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术[M].北京：科学出版社,1998：598-599.

[7]Roder M S,Plaschke J,Konig S U,et al.Abundance,variability and chromosomal location ofmicrosatellites in wheat[J].Mol Gen Genet,1995,246（3）：327-333.

[8]Roder M S,Korzun V,Wendehake K,et al.Amicrosatellite map ofwheat[J].Genetics,1998,149（4）：2007-2023.