基于与葡萄糖美拉德反应的低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性能

孙 涛，陈春红，朱 云，谢 晶

(上海海洋大学食品学院，上海 201306)

基于与葡萄糖美拉德反应的低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性能

孙 涛，陈春红，朱 云，谢 晶

(上海海洋大学食品学院，上海 201306)

以低聚壳聚糖作为氨基供体与提供羰基的葡萄糖进行美拉德反应(氨基与羰基的物质的量比分别为1:1、1:3和3:1)，醇沉法提取反应4h的低聚壳聚糖衍生物 CG11-4、CG13-4、CG31-4以及8h的衍生物CG11-8、CG13-8和CG31-8。对6种衍生物进行红外表征和相对分子质量测定，并研究其对超氧阴离子自由基(O2·)、羟自由基(·OH)和DPPH自由基的清除能力以及还原能力。结果显示：低聚壳聚糖衍生物对O2·、·OH和DPPH自由基的清除能力以及还原能力均较低聚壳聚糖得到显著提高，且羰氨物质的量比相同时，8h衍生物的抗氧化性均优于4h的衍生物，即随着反应的进行低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性能增强。

低聚壳聚糖；美拉德反应；反应时间；抗氧化性

美拉德反应主要是指食品中的氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白质)与羰基化合物(糖类)发生的复杂反应。不同反应阶段会产生不同物质，产物中除了最终阶段生成的一些高分子化合物，如蛋白黑素外，还有一系列中间阶段的产物——还原酮及含N、S的杂环化合物[1]。大量研究表明这类物质具有一定的抗氧化、抗诱变、抗病毒等特性[2-3]。美拉德反应的产物结构复杂、种类繁多，与反应时间、温度、pH值、参与反应的糖和氨基酸等有很大关系[4]。

低聚壳聚糖的抗氧化作用日益受到广泛关注，化学改性可以改变低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性。低聚壳聚糖经醚化[5]、季铵化等改性后[6-7]，其衍生物的抗氧化性降低；而经硫酸酯化[8]以及一些接枝反应[9]后，所得衍生物的抗氧化性有所提高。由于含有大量游离氨基，低聚壳聚糖可以作为氨基的供应体与还原糖发生美拉德反应。本研究以美拉德反应作为低聚壳聚糖改性的手段，不同物质的量比的羰氨与葡萄糖反应，制得不同反应时间的低聚壳聚糖衍生物，考察衍生物对O2·、·OH、DPPH自由基的清除能力以及还原能力，为拓宽低聚壳聚糖的改性和开发天然高效的抗氧化剂提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低聚壳聚糖(纯度＞90%，脱乙酰度＞90%，凝胶色谱测定其分子质量为8190D)，购自浙江金壳生物化学有限公司；鲁米诺、DPPH 美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯，购自上海化学试剂公司；抗氧化测试所需溶液由二次蒸馏水配制。

1.2 仪器与设备

WFZ UV2000型紫外分光光度计 上海合利仪器有限公司；970CRT荧光分光光度计 南京昕航科学仪器有限公司；EQUINOX 55傅里叶红外-拉曼光谱仪 德国布鲁克公司；Waters 515型凝胶色谱仪 美国Waters公司；IFFM 2D型流动注射化学发光分析仪 西安瑞迈科技有限公司。

1.3 低聚壳聚糖衍生物的制备

称取壳聚糖20.0g 3份，分别加入葡萄糖20.0、60.0g和6.7g，使得壳聚糖氨基和葡萄糖羰基的物质的量比为1:1、1:3、3:1，用200mL的二次蒸馏水溶解，在80℃条件下回流反应。反应中通过吸光度变化来监测反应的进程[10]，确立8h为最终反应时间。反应4h和8h后，产物多次醇提，经碘量法[11]测定无葡萄糖存在，烘干得壳聚糖衍生物CG11-4、CG13-4、CG31-4；CG11-8、CG13-8、CG31-8。

1.4 测试表征

红外光谱在EQUINOX 55傅里叶红外-拉曼光谱仪上进行，采用KBr压片法制样，测定波数范围为500～4000cm-1，分辨率为0.8cm-1。

产物的相对平均分子质量及其分布采用GPC法测定。GPC测试条件如下：流动相：0.2mol/L醋酸钠和醋酸缓冲溶液，pH4.8；监测器：Waters 2410示差折光监测器；柱子：TOSOH BIOSEP TSK-Gel G4000SWXL(7.8mm×300mm)；温度：40℃；标准物质为：葡聚糖。

1.5 抗氧化性能测定

1.5.1 对O2·的清除作用

O2·清除能力的测定参照参考文献[6]进行，用流动注射化学发光分析仪测定样品溶液的峰面积。

式中：S0为空白溶液峰面积；Si为样品溶液峰面积。

1.5.2 对·OH的清除作用

·OH的清除能力测定参照参考文献[6]进行，依上述流动注射化学发光分析方法测定并计算样品清除·OH的活性，计算公式同1.5.1节。

1.5.3 对DPPH自由基的清除作用

取不同浓度的样品溶液2.0mL，分别加入装有2.0mL的浓度为1×10-4mol/L DPPH无水乙醇溶液的比色管中，室温下避光静置30min，在517nm波长处测量吸光度Ai。用去离子水代替样品溶液，得吸光度A0，无水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj[12]。

1.5.4 还原能力的测定

还原能力根据文献[13]测定并稍做改进。取2.0mL不同浓度的样品，加入pH6.60的0.2mol/L磷酸缓冲液、质量分数为1%的铁氰化钾溶液各2.5mL，混匀，50℃水浴20min后迅速冷却，加入2.5mL质量分数为10%的三氯乙酸溶液，混匀后3000r/min离心10min，取上清液2.0mL，加入2.5mL去离子水和0.5mL质量分数为0.1%的三氯化铁溶液，静置10min后在700nm波长处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 低聚壳聚糖美拉德衍生物的测试表征

图1 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物的红外光谱图Fig.1 IR spectra of COS and its derivatives

图1是低聚壳聚糖及其衍生物的红外光谱图。低聚壳聚糖及其衍生物在1100cm-1附近都有3个较强的多糖特征吸收峰，分别是1037、1085、1155cm-1，这些吸收峰都来自壳聚糖主链环状结构，可作为判定低聚壳聚糖及其衍生物存在的特征吸收峰[6]。低聚壳聚糖在1622、1516、1381cm-1附近的吸附带，分别归因于酰胺I(C＝O)、自由氨基(—NH2)和酰胺Ⅲ[14]。图中显示低聚壳聚糖美拉德衍生物在1516cm-1的峰较低聚壳聚糖有明显降低，表明了自由氨基的减少，即低聚壳聚糖参与了美拉德反应；同时，在1155、896cm-1处的吸收峰，分别归因于C—O伸缩振动和β-D-氨基葡萄糖结构，当加入葡萄糖进行美拉德反应后，该处吸收峰渐渐降低，表明壳聚糖的糖单元发生了变化[15]。

采用GPC法，测得样品低聚壳聚糖的相对分子质量为8190，低聚壳聚糖衍生物CG11-4、CG11-8、CG13-4、CG13-8、CG31-4和CG31-8的相对分子质量分别为9850、12430、10540、11540、11860和11800。美拉德衍生物的相对分子质量较低的聚壳聚糖都有所增加，表明低聚壳聚糖分子中的游离氨基酸和还原糖基团相互反应形成了更大的分子。

2.2 低聚壳聚糖美拉德衍生物对O2·的清除

图2 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物对O2·的清除能力Fig.2 Superoxide anion scavenging activities of COS, CG11-4, CG11-8,CG13-4, CG13-8, CG31-4 and CG31-8

图2描述了低聚壳聚糖及其3种羰氨不同物质的量比反应衍生物对·的清除效果。在1:1体系中，CG11-4和CG11-8的IC50(对自由基清除率为50%时所需要的自由基清除剂浓度)分别为0.090、0.066mmol/L，而低聚壳聚糖的IC50为0.198mmol/L，可见两种衍生物对的清除能力均优于低聚壳聚糖，且反应8h的衍生物抗氧化活性明显优于4h的衍生物；此外，CG13-4和CG13-8的IC50分别为0.097、0.077mmol/L；CG31-4和CG31-8的IC50分别为0.091、0.078mmol/L，可见对的清除能力强弱顺序为CG13-8＞CG13-4＞COS；CG31-8＞CG31-4＞COS。研究表明，低聚壳聚糖对的清除活性可能与其分子中的活性羟基和氨基有关[16]，低聚壳聚糖作为氨基的供体与提供羰基的葡萄糖发生美拉德反应其活性氨基含量下降，但其衍生物对的清除能力有所提升，且3种比例下反应8h的衍生物抗氧化活性均优于反应4h的衍生物。

2.3 低聚壳聚糖美拉德衍生物对·OH的清除

图3 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物对·OH的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activities of COS, CG11-4, CG11-8,CG13-4, CG13-8, CG31-4 and CG31-8

·O H清除率是反映物质抗氧化作用的重要指标。·OH在其氧原子上含有一个未配对电子，夺取电子的能力很强，是体内最活泼的活性氧，可导致许多病理变化[17]。3种羰氨不同物质的量比低聚壳聚糖及其美拉德衍生物对·O H的清除活性如图3所示，对·OH的清除能力强弱次序为CG11-8＞CG11-4＞COS；CG13-8＞CG13-4＞COS；CG31-8＞CG31-4＞COS。即美拉德反应的低聚壳聚糖衍生物对·OH的清除活性较低聚壳聚糖均得到提升，且与葡萄糖反应8h的衍生物对·OH的清除能力更强，此现象与对O2·的清除效果相一致。

2.4 低聚壳聚糖美拉德衍生物对DPPH自由基的清除

图4 低聚壳聚糖及其美拉德衍生物对DPPH自由基的清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging activities of COS, CG11-4, CG11-8,CG13-4, CG13-8, CG31-4 and CG31-8

图4描述3种羰氨不同物质的量比壳聚糖及其衍生物对DPPH自由基的清除能力。CG11-4和CG11-8的IC50分别为0.047、0.022mmol/L，CG13-4、CG13-8的IC50分别为0.032、0.026mmol/L，CG31-4和CG31-8的IC50分别为0.029、0.025mmol/L，而COS的IC50为0.142mmol/L。即对DPPH自由基的清除能力强弱次序为CG11-8＞CG11-4＞COS；CG13-8＞CG13-4＞COS；CG31-8＞CG31-4＞COS。这一结果同样与对O2·和·OH的清除结果相似。

2.5 低聚壳聚糖美拉德衍生物的还原能力

还原能力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，通过提供电子，阻断了Fe2+向Fe3+的转变，从而表现出一定的还原能力。研究表明，抗氧化活性和还原能力之间存在着密切的关系[18]。如图5所示，在浓度为0.20mmol/L时，CG11-4和CG11-8的吸光度分别为0.850和1.377，CG13-4和CG13-8的吸光度分别为1.111和1.274，CG31-4和CG31-8的吸光度分别为0.771和0.868，而COS的吸光度为0.330。即还原能力强弱顺序为CG11-8＞CG11-4＞COS；CG13-8＞CG13-4＞COS；CG31-8＞CG31-4＞COS，这与前面的结果保持一致。

3 结 论

本实验以美拉德反应为低聚壳聚糖的改性手段，在3种羰氨不同物质的量比与葡萄糖反应来制备低聚壳聚糖衍生物，并检测了低聚壳聚糖及其衍生物对O2·、·OH和DPPH自由基的清除能力以及还原能力。壳聚糖的抗氧化活性与其相对分子质量的大小密切相关[19]，低相对分子质量的壳聚糖抗氧化性优于高相对分子质量的壳聚糖，本研究中的原料低聚壳聚糖的相对分子质量为8190，具有一定的抗氧化活性。结果显示，美拉德反应后衍生物的相对分子质量较低聚壳聚糖都有所增加，但其抗氧化性均优于低聚壳聚糖，故可以认为美拉德反应是低聚壳聚糖改性的有效手段；3种羰氨不同物质的量比的低聚壳聚糖与葡萄糖美拉德反应的8h所得的衍生物抗氧化性均优于4h，说明在美拉德反应过程中，反应时间相对越长抗氧化性越佳，这可能与类黑素等褐变物质的积累有关，相关机理还有待进一步研究。本研究为制备天然、安全、高效的抗氧化剂提供了很好的思路。

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Antioxidant Activity Assessment of Chitosan Oligosaccharide Derivatives from Maillard Reaction with Glucose

SUN Tao，CHEN Chun-hong，ZHU Yun，XIE Jing
(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Maillard reaction was initiated by heating chitosan oligosaccharide (COS) with glucose at ratios of 1:1, 1:3 and 3:1 of amine group to carbonyl group, respectively. Chitosan oligosaccharide derivatives after 4 hours named CG11-4, CG13-4 and CG31-4 were extracted by alcohol precipitation, and CG13-8, CG31-8 and CG11-8 were obtained after 8 hours. All of the derivatives were characterized by fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and their molecular weight was determined by gel permeation chromatograph (GPC). Their antioxidant properties in vitro were investigated, including superoxide, hydroxyl and 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicals scavenging capabilities as well as reducing power. The results showed that all of the chitosan oligosaccharide derivatives had strong antioxidant activity when compared with chitosan oligosaccharide. The antioxidant activity was found to be in the order of CG11-8 ＞ CG11-4, CG13-8 ＞ CG13-4, CG31-8 ＞ CG31-4, indicating that the derivatives had the better antioxidant activity as the reaction processed.

chitosan oligosaccharide；Maillard reaction；reaction time；antioxidant activity

TS202.3

A

1002-6630(2011)03-0014-05

2010-05-26

上海市生物医药和农业科技领域重点科技项目(08391911500)；2009年上海市优秀学科带头人计划项目(09XD1402000)；上海市教委重点学科建设项目(J50704)

孙涛 (1970—)，女，副教授，博士，研究方向为多糖的改性及生物功能的开发。E-mail：taosun@shou.edu.cn