正己烷反应体系中酶法转化乙酸3-甲硫基丙醇酯的工艺条件

温明显，王成涛，赵 磊，杨雪莲，尹丽丽，童军茂

（1.石河子大学食品学院，新疆石河子832003；2.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048；3.北京工商大学食品风味化学北京市重点实验室，北京100048）

正己烷反应体系中酶法转化乙酸3-甲硫基丙醇酯的工艺条件

温明显1，2，王成涛2，3，*，赵 磊2，3，杨雪莲2，3，尹丽丽2，3，童军茂1

（1.石河子大学食品学院，新疆石河子832003；2.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048；3.北京工商大学食品风味化学北京市重点实验室，北京100048）

研究了脂肪酶催化合成天然香料乙酸3-甲硫基丙醇酯（EMTP）的关键因素及条件。以发酵3-甲硫基丙醇、乙酸为主要原料酶法合成EMTP的反应中，固定化Novozym 435脂肪酶为最佳催化剂，正己烷作为溶剂有利于提高酶活力；在正己烷反应体系中，Novozym435用量、分子筛吸水剂用量、乙酸加入次数、反应温度、反应时间等因素对EMTP合成有重要的影响，添加Novozyme435 50mg、分子筛2g、反应温度40℃、乙酸分3次加入、摇瓶速率100～150r/min，反应30h为较佳的反应条件，其EMTP产量为6.5mg/mL。

3-甲硫基丙醇，乙酸，乙酸3-甲硫基丙醇酯，脂肪酶非水相转化，正己烷反应体系

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙酸3-甲硫基丙醇酯、乙酸（发酵来源） 国药化学试剂公司；正己烷、叔丁醇、正庚烷、丙酮 分析纯，北京化学试剂公司；Novozym 435、Lipozyme TL 100L、Greasex 200 MG、Lipopan 50 BG、NovoCor ADL、Lipozyme TL 1M、Lipex 100T 丹麦诺维信公司；3-甲硫基丙醇 本课题组发酵法制备。

LC-20A型岛津高效液相色谱仪 岛津国际贸易有限公司；HQ45恒温摇床 中国科学院武汉科学仪器厂；DF-101S磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 3-甲硫基丙醇、乙酸3-甲硫基丙醇酯的液相色谱测定 液相色谱条件：LC-20A岛津液相色谱仪、色谱柱ODS-SP、二极管阵列检测器（4.6×150mm）；流动相：甲醇∶水=60∶40，柱温为室温，进样量20μL。3-甲硫基丙醇和乙酸3-甲硫基丙醇酯在此条件下其保留时间分别为4.1、16.35min。

配制系列3-甲硫基丙醇、乙酸3-甲硫基丙醇酯的甲醇溶液，液相色谱仪检测，绘制其标准曲线。

1.2.2 脂肪酶筛选 将3-甲硫基丙醇1mL和乙酸0.6mL分批次加入反应容器中，分别加入NovoCor ADL、Lipozyme TL 100L、Greasex 200 MG、Lipopan 50 BG、Lipozyme TL 1M、Lipex 100T各0.01mL以及Novozyme 435 0.05g，于温度45℃、摇床转速150r/min、密封反应6h，反应物液相色谱法测定乙酸3-甲硫基丙醇酯转化率。

1.2.3 溶剂筛选 分2～3次将0.6mL乙酸，1mL 3-甲硫基丙醇分别加入到10mL正己烷、丙酮、正庚烷、叔丁醇溶液体系中，50mg Novozyme 435、温度45℃、摇床转速150r/min、密封反应6h，反应物液相色谱法测定乙酸3-甲硫基丙醇酯转化率。

1.2.4 多种因素条件对乙酸3-甲硫基丙醇酯合成反应的影响 在正己烷体系加有1mL 3-甲硫基丙醇，0.6mL乙酸反应容器中，分别考察乙酸加入次数、反应温度、Novozym435酶用量、分子筛用量、反应时间等因素对乙酸3-甲硫基丙醇酯转化率的影响，反应物用液相色谱法测定。

2 结果与讨论

2.1 不同脂肪酶和有机溶剂对乙酸3-甲硫基丙醇酯合成反应的影响

选择来源于丹麦诺维信公司的7种脂肪酶Novozym 435、Lipozyme TL 100L、Greasex 200 MG、Lipopan 50 BG、NovoCor ADL、Lipozyme TL 1M、Lipex 100T为催化剂，以发酵3-甲硫基丙醇、乙酸为主要原料，分别考察在无溶剂和有机溶剂体系中乙酸3-甲硫基丙醇酯产量。图1结果表明，在无溶剂和有机溶剂2类反应体系中，考察的7种脂肪酶中固定化Novozyme 435催化合成EMTP产量都为最高，其他脂肪酶的催化产量很低，甚至低于3-甲硫基丙醇与乙酸直接混合的反应体系中EMTP产量（空白）；所实验的4种有机溶剂体系中，正己烷体系EMTP产量为最高，丙酮体系产量为最低；采用无溶剂反应体系EMTP产量为4.25mg/mL。本文重点阐述正己烷反应体系中因素条件对EMTP转化的影响，无溶剂体系中因素条件对EMTP转化的影响将另文说明。

图1 4种有机溶剂反应体系中不同脂肪酶对EMTP合成反应的影响

2.2 乙酸分批加入次数对EMTP合成反应的影响

以选定的Novozyme 435为催化剂，在正己烷反应体系中考察乙酸分批加入次数对EMTP转化率的影响。图2结果表明，乙酸分3～4次加入时产物EMTP转化率为最高，其产量约为1.5mg/mL，而1次性加入乙酸时产物EMTP产量约为0.28mg/mL，说明乙酸添加次数对脂肪酶的催化活性和产物EMTP的产量有重要影响，分析其原因可能是乙酸的量会影响反应体系pH及其微环境，进而影响Novozyme 435的催化活性。

图2 乙酸加入次数对EMTP合成反应的影响

2.3 反应温度对EMTP合成反应的影响

图3 反应温度对EMTP合成反应的影响

温度对酶的催化活性及效率有重要影响，一般高温有利于酶促反应速度，但高温会降低酶的稳定性，进而降低酶的使用次数。以Novozyme 435为催化剂，研究正己烷反应体系中反应温度对EMTP合成反应的影响。图3结果表明，反应温度对脂肪酶催化活性有较大影响，反应温度为40～45℃时产物乙酸3-甲硫基丙醇酯产量最高，约为1.28mg/mL。

2.4 加酶量对EMTP合成反应的影响

由图4可看出正己烷反应体系中脂肪酶的用量对EMTP合成反应及催化活性的影响，脂肪酶加入量50mg时，其产物乙酸3-甲硫基丙醇酯产量约为1.30mg/mL，继续增加脂肪酶用量其产量无明显提高。

图4 脂肪酶用量对EMTP合成反应的影响

2.5 分子筛加入量对EMTP合成反应的影响

正己烷反应体系中分子筛加入量对EMTP合成反应的影响见图5，结果表明，分子筛添加量对脂肪酶催化活性及EMTP合成反应有重要影响，尤其是在分子筛用量＜2g时，其产物EMTP产量较低，用量≥2g时EMTP产量有较大提高，达到4.60mg/mL以上。分析其原因，3-甲硫基丙醇、乙酸为底物的酯化反应是一个产生水的可逆反应，酯化反应和水解反应同时进行，加入分子筛吸水剂，有利于酯化反应的进行，因此分子筛吸水剂的添加量对非水相条件脂肪酶催化活性及转化率有重要影响，适量添加吸水剂有利于提高EMTP的转化率。

图5 分子筛用量对EMTP合成反应的影响

2.6 反应时间对EMTP合成反应的影响

正己烷反应体系中添加固定化Novozyme 435 50mg、分子筛2g、反应温度40℃、乙酸分3次加入、100～150r/min摇瓶速率是较好的反应条件（图6），在此条件下研究无溶剂反应体系中反应时间为30h时，产物EMTP产量约为6.5mg/mL，转化率约为11.0%。

3 结论

图6 反应时间对EMTP合成反应的影响

以发酵3-甲硫基丙醇和乙酸为主要原料脂肪酶转化合成EMTP是可行的。固定化Novozym 435脂肪酶是最佳催化剂，正己烷作为溶剂有利于提高酶活力和合成反应；在正己烷反应体系中Novozym435用量、分子筛吸水剂用量、乙酸加入次数、反应温度、反应时间等是关键因素条件，对EMTP产量及酶活力有重要影响；在正己烷体系中优化后反应的条件为：添加Novozyme 435 50mg、分子筛2g、反应温度40℃、乙酸分3次加入、摇瓶速率100～150r/min，反应30h，在此条件下EMTP产量为6.5mg/mL。

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Preparation of natural aroma ethyl-3-methyl-thiopropionate（EMTP）from biocatalysis reaction in normal hexane system

WEN Ming-xian1,2,WANG Cheng-tao2,3，*,ZHAO Lei2,3,YANG Xue-lian2,3,YIN Li-li2,3，TONG Jun-mao1
（1.College of Food,Shihezi University,Shihezi 832003,China；2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048，China；3.Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China）

The production of natural aroma ethyl-3-methyl-thiopropionate (EMTP)by biocatalytic synthesis in non-aqueous system was studied.The results indicated that the best catalyst dosage was immobilized lipase Novozym435，and normal hexane as solvent was helpful to improve the activity of lipase in the reaction system. the amount of Novozym435，molecular sieve，the added times of acetic acid，reaction temperature，reaction time were important factors on the EMTP synthesis.And the optimal conditions in normal hexane medium were that lipase 50mg，molecular sieve 2g，reaction temperature 40℃，reaction time 30h，three times of acetic acid added，shaked speed 150r/min.The production rate of EMTP reached 6.5mg/mL under the optimized operation conditions.

methionol；acetic acid；ethyl-3-methyl-thiopropionate；lipase-catalyzed synthesis；normal hexane reaction system

TS201.2

B

1002-0306（2011）10-0212-03

乙酸3-甲硫基丙醇酯（Ethyl-3-methylthiopropionate，EMTP）天然存在于菠萝、西瓜、鸭梨、啤酒、葡萄酒、威士忌和白兰地中[1-4]；在氨基酸生物降解过程中，也产生少量的EMTP[5]。EMTP具有浓烈的菠萝特征香味，是调配菠萝、柑橘、辣根、番茄、洋葱、猪肉、牛肉、鸡肉、巧克力等多种果味香精、肉味香精和酒用香精的常用香料[1，3]。目前含硫酯类香料主要通过化学合成生产，反应需要高温酸碱催化，反应条件苛刻，能耗高环境污染严重[6-7]。脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3.）是一类特殊的酯键水解酶，不仅能催化甘油脂肪酸酯水解，还能催化酯类物质合成或转酯反应。非水相体系中脂肪酶可催化合成酯类香料，反应条件温和，可增加有机底物的溶解性，改变反应的平衡方向，提高反应的立体选择性，抑制水参与的副反应，易于消除底物和产物的抑制作用等，成为重要的绿色化学主要技术之一[6，8]。生物转化制备的香料，其构型、手性单一，有助于香气品质的提高，是近年来天然香料制备的重要发展方向[9-12]。本文以发酵3-甲硫基丙醇和发酵冰醋酸为主要原料，以脂肪酶为催化剂，研究天然乙酸3-甲硫基丙醇酯的生物转化，优化其非水相条件。

2011-08-02 *通讯联系人

温明显（1985-），男，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

国家自然科学基金项目（31071593）；北京市教委科技面上项目（KM201110011001）；北京市属高校人才强教计划项目（PHR201008237）。