造纸黑液与无机肥对草地早熟禾抗寒性的影响比较

文秋明，莫海涛，张小勇

(1.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190；2.中国科学院研究生院，北京 100049)

造纸黑液与无机肥对草地早熟禾抗寒性的影响比较

文秋明1，2，莫海涛1，张小勇1

(1.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190；2.中国科学院研究生院，北京 100049)

在晚秋自然降温过程中，通过对草地早熟禾(Poapratensis)叶片生理生化指标和表观品质的跟踪测定、比较，研究了造纸黑液和无机肥对草地早熟禾抗寒性的影响。结果表明，造纸黑液和无机肥不同程度地提高了草地早熟禾抗寒锻炼的效果。无机肥显著促进了草地早熟禾叶片游离脯氨酸(Fpro)的积累，最大含量为868.95 μg/g。造纸黑液显著提高了草地早熟禾叶片的超氧化物歧化酶(SOD)活性和可溶性糖(WSS)含量，最大值分别为201.16 U/g和137.15 μg/g。无机肥处理延长草坪绿期约10 d，造纸黑液处理延长草坪达40 d。相对于无机肥，造纸黑液更为显著地提高了草地早熟禾的抗寒性，并保持了较高的草坪观赏性。

草地早熟禾；生理生化指标；造纸黑液；抗寒性；抗寒锻炼

草坪具有美化环境、保持水土、吸尘杀菌、制造氧气等诸多作用，并为人们提供了休闲和娱乐场所。随着草坪业的蓬勃发展，草坪的建植与养护管理也逐步走上科学化道路。而如何解决草坪草的冻枯问题，延长草坪草的绿期，增加草坪的景观和使用价值，始终是我国草坪学领域的主要研究内容之一[1]。目前国内外提高草坪草抗寒性的途径主要有冬季覆盖[2-3]、抗寒锻炼[4-6]、品种选育[7-8]、化学诱导[9]和施肥[10]。施肥是草坪养护管理体系中最经济、最有效的手段之一。Voigt和Fermanian[11]对具有丰富的草坪教学和管理研究经验的几百名专家进行的调查表明，草坪施肥是改善草坪品质和维护草坪持久性的决定因素。目前通过施肥来延长草坪绿期的研究多集中在单施或配比施用氮、磷、钾等无机肥和粪肥、堆肥等有机肥[12]，而将腐植酸肥料用于增强草坪草抗寒性的研究报道还较为少见。造纸黑液是植物纤维原料(如木材、麦草和稻草等)经碱法制浆蒸煮后所得的废液，富含低分子量腐植酸和纤维素降解物以及木糖、氮、磷、钾等物质。造纸黑液腐植酸和煤炭腐植酸在组成结构及对土壤和作物的影响等方面有类似之处。早在20世纪70年代研究造纸黑液腐植酸在农业生产中的应用，就引起了许多国家科技工作者的兴趣[13]，而将造纸黑液喷施于草坪以延长草坪绿期的研究鲜见报道。

本试验在秋季低温来临前分别对试验区域草地早熟禾喷施清水、无机肥和造纸黑液。以实验室生理生化指标测定和田间表观性状打分相结合的方法，跟踪测定了草地早熟禾的电解质渗透率(EL)，超氧化物歧化酶(SOD)活性，丙二醛(MDA)、叶绿素(Chl)、脯氨酸(Fpro)和可溶性糖(WSS)含量6个生理生化指标以及草坪盖度、密度、质地、色泽、绿期和均一性6项表观性状，全面客观地评价了不同处理对草地早熟禾抗寒保绿的作用效果，为进一步研究草坪草的抗寒性，延长草坪绿期提供科学依据。

1 材料与方法

1.1试验地概况 试验地位于北京市区的中国科学院过程工程研究所东区草坪，116°33′ E，39°99′ N,海拔46 m，属暖温带大陆性季风气候，年均温11.6 ℃。试验期间极端最高气温25.8 ℃，极端最低气温-10.4 ℃。试验地土壤为淋溶褐土，质地为粘壤土，属中性。土壤有机质含量14.90 g/kg，速效氮89.92 mg/kg，速效磷47.51 mg/kg，速效钾22.13 mg/kg，pH值7.85。

2008年10月1日进行草地早熟禾田间抗寒试验，记录试验期间每日气温(图1)。北京10月日均气温在7～19 ℃，11月日均气温在1～12 ℃波动，12月日均气温锐减到零下并在-9～3 ℃波动。整个试验期间北京日均气温有5次骤降，第1次是10月上旬由19 ℃大幅度降至11 ℃，第2次是10月下旬由17 ℃降至7 ℃，第3次是11月中旬由8 ℃降至1 ℃，第4次是12月上旬由4 ℃降至-7 ℃，第5次是12月中旬由1 ℃降至-9 ℃。

图1 田间试验期间北京日均气温

1.2试验材料 草地早熟禾(Poapratensis)英文名Kentucky Bluegrass，别名六月禾，禾本科早熟禾属多年生草本植物，是世界上利用最广泛的冷季型草坪植物，适宜于公园、学校、庭院、街道等公共场所作为观赏草坪。

试验用无机肥为国产尿素(氮含量46%)，磷酸二铵(磷含量46%、氮含量16%)，氯化钾(钾含量60%)。

造纸黑液为亚铵黑液，由中国科学院过程工程研究所提供，其腐植酸含量为5.3%，氮含量为2.8%。

1.3试验设计 试验设空白对照、无机肥、造纸黑液3个处理。无机肥的施用量设定为尿素∶磷酸二铵∶氯化钾为10∶15∶12 g/m2。造纸黑液的施用量为250 mL/m2，其中氮含量与无机肥中氮含量相当。每个施肥小区面积为2 m×4 m，各施肥小区之间有2 m宽的保护带。

1.4抗寒性评价方法 采集草地早熟禾的叶片，每15 d检测一次，直至空白对照小区草坪完全枯黄。参照邹琦的方法[14]，EL的测定采用电导法，SOD活性的测定采用SOD抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原法，MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法，Chl含量的测定采用乙醇研磨提取法，Fpro含量的测定采用磺基水杨酸提取法，WSS含量的测定采用蒽酮比色法。

1.5观赏性评价方法 用目测法观测各试验小区草坪的盖度、密度、质地、色泽、绿期和均一性6项性状。试验期间总共观测3次，观测日期分别为10月1日，11月1日和12月1日，均于16:00观测，以防止露珠和阳光影响。观测结果采用国际通用的草坪质量“9分制”方法评价，其中1分为最差，9分为最好，5分为可接受水平。最后将各小区草坪性状进行加权评分，得分高者表示观赏性好。

2 结果与分析

2.1不同处理对草地早熟禾的抗寒性影响 质膜是冻害的原初部位和主要部位[15]，低温胁迫能引起植物细胞透性的明显改变，导致溶质外渗。低温条件下，EL与植物的抗寒性呈负相关。由图2可知，降温初期草地早熟禾得到抗寒锻炼，植物体内的保护系统可逆性地缓解了低温对膜系统的伤害，电解质渗透率下降。12月上旬气温骤降至零下，草地早熟禾受到冷冻伤害，组织胞间结冰，冰晶体积膨大直接破坏质膜结构，EL急剧上升，不同处理间叶片EL差异显著(P<0.05)。造纸黑液处理叶片的EL增加相对缓慢，说明其受到的低温伤害比无机肥处理小。

图2 不同处理对草地早熟禾叶片电解质渗透率的影响

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下图同。

低温环境下植物体内活性氧自由基积累，引起膜脂过氧化，导致植物冷冻害。SOD作为植物体内重要的保护酶，可清除活性氧自由基进而减轻对植物的伤害，因此成为评价植物抗寒性的重要指标[16]。由图3可知，试验期间不同处理下草地早熟禾叶片的SOD活性均呈现先上升后下降的趋势。在降温初期，草地早熟禾得到抗寒锻炼，其叶片SOD活性明显提高。造纸黑液处理叶片SOD活性上升显著(P<0.05)，最高达201.16 U/g。当气温降至零下时，SOD迅速失活。造纸黑液处理的SOD活性上升幅度显著高于无机肥处理，表明造纸黑液能够强化植物体抗寒锻炼的效果，提高其抵御逆境的能力。

图3 不同处理对草地早熟禾叶片超氧化物歧化酶活性的影响

MDA是植物遭受低温逆境时，生物膜系统膜脂过氧化的最终产物，其浓度的高低代表膜脂过氧化强度及膜系统的伤害程度[17]。由图4可知，降温前期草地早熟禾叶片的MDA含量明显下降，表明植物体膜系统膜脂过氧化程度减轻，植物抗寒性增强；当日均气温锐减至零下时，细胞受到严重伤害，MDA迅速大量累积。整个试验期间不同处理间叶片MDA含量差异显著(P<0.05)。由MDA变化趋势可知造纸黑液处理的抗寒性最强，无机肥处理次之，对照草坪最弱。

图4 不同处理对草地早熟禾叶片丙二醛含量的影响

Chl含量高，在一定条件下能够提高光合作用能力，提供更多光合产物供植物体的生长和利用，因此可作为植物抗寒能力的生理指标。一般来说，Chl合成的最适温度是30 ℃左右，最低温度是3℃左右[18]。由图5可知，进入10月以后，日均气温降为20 ℃以下，Chl合成速率随之降低；12月上旬日均气温骤降为零下，阻碍Chl合成，草地早熟禾叶片的Chl含量急剧减少。无机肥处理叶片的Chl含量在低温前期保持较高水平，但与其他处理差异不显著(P>0.05)。造纸黑液处理的Chl含量在整个试验期间呈缓慢下降趋势，与其他处理差异显著(P<0.05)。表明植物体在低温胁迫下仍能保持一定的绿色，这与田间观测结果一致。

图5 不同处理对草地早熟禾叶片叶绿素含量的影响

Fpro是植物体内一种最有效的亲和性渗透调节物质[19]，可以防止失水，增强蛋白质的水合作用，保护生物大分子结构和功能的稳定。试验期间不同处理叶片的Fpro含量均呈现先上升后下降的变化趋势。降温前期无机肥处理的Fpro含量上升最快，且与其他处理差异显著(P<0.05)，最大值达到868.95 μg/g，显示出较好的抗寒能力。降温后期造纸黑液处理的Fpro含量下降最缓慢，且与其他处理差异显著(P<0.05)，表明受到的冷冻伤害最轻(图6)。

图6 不同处理对草地早熟禾叶片脯氨酸含量的影响

WSS可提高细胞液的浓度，增加细胞持水能力，从而降低细胞质的冰点[20]。植物在逆境下会主动积累WSS以适应外界环境的变化。施用造纸黑液和无机肥均可使草地早熟禾叶片的WSS含量达到较高水平，对植物体起到较好的保护作用。造纸黑液处理叶片WSS含量最高为137.15 μg/g，与其他处理差异显著(P<0.05)。受到冰冻伤害后，无机肥处理叶片的WSS含量急剧减少，植物体抵御伤害的能力随之下降，而造纸黑液处理叶片的变化相对缓和，表明其抗寒能力较强(图7)。

2.2不同处理对草地早熟禾的观赏性影响 自然降温过程草地早熟禾观赏性评定指标的观测结果见表1。随着北京日均气温逐渐降低，草坪草受到愈加严重的低温伤害，各项表观性状明显下降。植物体于11月中旬开始干枯、死亡，草坪出现较为明显的裸露地面。由表中可以看出，造纸黑液处理的草坪盖度、质地、绿期和均一性均优于无机肥处理，密度与无机肥处理未见明显差异，而色泽与对照接近，比无机肥处理稍差。田间观测发现，经历了4次气温骤降后，对照区域草坪在12月中旬达到半数枯黄，于1月上旬完全枯黄，12月中旬日均气温再次锐减。

图7 不同处理对草地早熟禾叶片可溶性糖含量的影响

处理盖度密度质地色泽绿期均一性对照 657856无机肥 787967造纸黑液888889

注：除绿期是根据保绿天数一次性打分外，其余5项表观性状的打分均是3次田间观测的平均值。

无机肥处理区域草坪迅速进入枯黄期，在1月中旬完全枯黄，较对照草坪绿期延长10 d左右；造纸黑液处理区域草坪在1月下旬进入枯黄期，较对照延长绿期40 d左右。

为了对草地早熟禾的观赏性品质有一个综合的评价，对自然降温过程草地早熟禾的各项性状观测结果进行加权和评分，得出盖度、密度、质地、色泽、绿期和均一性的权重分别为0.10、0.10、0.20、0.15、0.25和0.20，加权平均分越高则表示该小区草坪的观赏性越好。

列出模糊关系阵，求得综合评定Y：

W=(0.10,0.10,0.20,0.15,0.25,0.20)

Y=W

R=(6.15，7.15，8.20)

对照的观赏性得分是6.15，无机肥处理的得分是7.40，造纸黑液处理的得分最高，为8.20，说明在秋冬季节低温胁迫下，对照草坪的各项表观品质迅速下降，喷施无机肥和造纸黑液都能不同程度地减缓这种趋势。造纸黑液处理的草坪保持了较高的观赏性，表明植物体抵御低温的能力得到了明显提高。

3 讨论与结论

3.1膜系统 正常情况下，植物体内活性氧自由基不断产生，同时不断被超氧化物歧化酶清除，二者处于动态平衡状态。逆境时活性氧累积过多，引起膜脂过氧化，产生大量膜脂过氧化产物丙二醛，导致膜相变和膜结构破坏，电解质渗透率随之上升[18]。10月的2次气温骤降使草地早熟禾得到抗寒锻炼，尤其是造纸黑液处理，其叶片超氧化物歧化酶活性显著提高，显示了较好的抗寒能力。超氧化物歧化酶清除细胞内自由基，保护膜系统，使丙二醛降至较低水平。进入12月后气温降至零下，植物受到了冰冻伤害，超氧化物歧化酶迅速失活，丙二醛大量累积，同时质膜受到冰晶机械损伤，产生不可逆的严重伤害，电解质渗透率迅速上升。结果表明，相对于无机肥，造纸黑液更为显著地提高了草地早熟禾抗寒锻炼的效果，减缓了冷冻对膜系统造成的伤害。

3.2调节渗透物质 脯氨酸和可溶性糖都是植物体内重要的渗透调节物质，低温胁迫下脯氨酸和可溶性糖都会大量累积以适应逆境[21]。无机肥提供了叶绿素生物合成所必需的氮元素，使得叶绿素在低温前期保持较高水平， 因而光合作用较强，脯氨酸和可溶性糖含量明显高于造纸黑液处理。随着气温进一步降低，植物体把在叶片合成的脯氨酸和可溶性糖转移至根部以抵御冷冻胁迫[22]。无机肥中的钾、磷等参与糖类的转化和运输，使无机肥处理叶片的脯氨酸和可溶性糖迅速转移至地下，提高了根部的抗寒性。而本试验显示，造纸黑液处理叶片的脯氨酸和可溶性糖含量减少相对缓慢，保持了地上部分较好的抗寒性。

3.3观赏性 在田间自然降温过程中，造纸黑液处理区域的草地早熟禾保持了较好的观赏性。其中草坪盖度、质地、绿期和均一性均优于无机肥处理，密度与无机肥处理未见明显差异，而色泽比无机肥处理稍差。这可能是因为无机肥中的氮能被植物体快速吸收，促进叶绿素合成，而造纸黑液中的氮受到腐植酸的缓释作用，虽然短期效果不如无机肥显著，但延长了肥效，其处理区域草坪的绿期比无机肥处理草坪长。

3.4绿期 绿期是指草坪草一年中保持绿色的天数，通常统计从草坪返青达1/2到草坪枯黄达1/2期间的天数。北京地区草地早熟禾的绿期为290 d左右，一般12月下旬枯黄，3月中下旬返青。本试验表明，喷施无机肥的草坪绿期较对照延长约10 d，喷施造纸黑液的草坪绿期延长约40 d。值得注意的是，造纸黑液处理区域草坪一直保持半数枯黄状态直至3月上旬提前返青。造纸黑液对草地早熟禾返青的影响有待进一步研究。

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ComparisonofeffectsofpulpingblackliquorandinorganicfertilizerapplicationonthecoldresistanceofPoapratensis

WEN Qiu-ming1,2,MO Hai-tao1,ZHANG Xiao-yong1

(1.National Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China; 2.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The physiological and biochemical indexes and apparent quality of leaves were trace-determined in autumn to compare the effects of pulping black liquor and inorganic fertilizer application on the cold resistance ofPoapratensis. The results of this study showed that the pulping black liquor and inorganic fertilizer enhanced the cold hardening effect ofP.pratensisto some degrees. The inorganic fertilizer increased the accumulation of free proline with a maximum concentration of 868.95 μg/g, while the pulping black liquor increased the activity of superoxide dismutase (SOD) with 201.16 U/g and the content of soluble sugar (WSS) with 137.15 μg/g. The inorganic fertilizer prolonged the turf green period for about 10 days, while the pulping black liquor did it for about 40 days. The pulping black liquor enhanced the cold resistance ofP.pratensismore effectively and maintained a higher apparent quality.

Poapratensis; physiological and biochemical indexes; pulping black liquor; cold resistance; cold hardening

S543.034；S141.8

A

1001-0629(2011)01-0047-06

2010-03-23 接受日期：2010-05-20

中国科学院农业创新项目(KSCX2-YW-N-41-04)

文秋明(1984-)，女，广西桂林人，在读硕士生，研究方向为农业生化工程。

E-mail:qmwen@home.ipe.ac.cn

张小勇 E-mail:xyzhang@home.ipe.ac.cn