三聚氰胺在不同流动相体系中的紫外吸收光谱

曹小彦 彭新凯 汪 辉 胡朝晖 黎 瑛 夏延斌

（1.长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南 长沙 410013；2.湖南农业大学食品科学学院，湖南 长沙 410128）

三聚氰胺在不同流动相体系中的紫外吸收光谱

曹小彦1，2彭新凯1汪 辉1胡朝晖1黎 瑛1夏延斌2

（1.长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南 长沙 410013；2.湖南农业大学食品科学学院，湖南 长沙 410128）

研究三聚氰胺在不同流动相中的紫外吸收情况。结果表明：三聚氰胺在不同溶剂中的紫外吸收不同，使用不同流动相测定三聚氰胺时，应选取相对应的检测波长。在没有柠檬酸体系的流动相中应采用203nm左右或236nm左右的检测波长；而在有柠檬酸体系的流动相中应采用236nm左右的检测波长。

三聚氰胺；流动相；紫外吸收光谱；色谱

2007年美国发生的许多猫狗宠物非正常死亡事件（美国FDA经过调查确认是宠物食品的原料受非法添加的三聚氰胺污染，原料来自中国）和2008年“三鹿奶粉”事件引起了极大的社会反响。三聚氰胺即蜜胺（结构式见图1），又称氰尿酰胺，白色晶体，相对密度1.573（250℃），熔点354℃，难溶于水、乙二醇、甘油和吡啶，略溶于乙醇，不溶于乙醚、苯和四氯化碳［1］。它是一种非食品添加剂，之所以被加入至食品中是因为三聚氰胺含氮量高达66.7%，可以增加食品的含氮量，冒充高蛋白食品，从而大幅度降低成本。而目前常用来检测蛋白质的“凯氏定氮法”，检测饲料和食品中的粗蛋白质的含量，其实只是检测氮的含量，再根据蛋白质的含氮量（15%～17%）折算成蛋白质的含量，因此无法区分真假蛋白质。

图1 三聚氰胺结构式Figure 1 The configuration of melamine

目前国内外测定食品中三聚氰胺含量的方法一般采用液相色 谱 法［2－4］、液 相 － 质 谱 法［5，6］、气 相 － 质 谱 法［7］等。HPLC－UV色谱法是研究和鉴定三聚氰胺的最有效的方法之一。对不同流动相体系的紫外吸收光谱的研究是HPLC－UV色谱法的理论基础，通过研究不同流动相体系的紫外吸收光谱，为找出相对应的检测波长，提高灵敏度，降低检出限提供理论指导。但国内外关于三聚氰胺在不同流动相体系中的紫外吸收光谱的研究还未见报道。溶剂是影响三聚氰胺紫外吸收光谱的重要因素，本试验通过对三聚氰胺在不同流动相中的紫外吸收的研究，找出在有无柠檬酸体系的流动相中的最佳检测波长。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

高效液相色谱仪（配VWD检测器）：Agilent 1200，美国安捷伦科技有限公司；

双光束紫外可见分光光度仪：TU－1900，北京普析通用仪器有限公司。

1.2 主要试剂

三聚氰胺标准品：＞99.5%，国家标准物质中心；

庚烷磺酸钠，乙腈，甲醇，辛烷磺酸钠：均为色谱纯；

柠檬酸，硫酸铵，磷酸二氢钾：均为分析纯。

1.3 试验方法

根据中国国家标准（GB／T 22388——2008）［2］及参考文献［8］中高效液相色谱法测定三聚氰胺含量所采用的不同流动相和三聚氰胺在不同溶剂中的溶解情况，精确称取一定量的三聚氰胺标准品，分别用流动相定容（见表1），配置成浓度为5μg／mL的三聚氰胺溶液，在TU－1900双光束紫外可见分光光度仪中进行分析，依次对各样品在190～400nm波长范围内进行紫外波长扫描，狭缝宽度为0.5nm，石英比色皿厚度为1cm，用相对应的空白溶剂作参比。

表1 流动相与对应的检测波长Table 1 Mobile phase and corresponding determination wavelengh

HPLC的操作方法均采用相对应中国国家标准［2］及参考文献［3－8］所述方法。

2 结果与分析

2.1 三聚氰胺在不同溶剂中的紫外吸收

配置三聚氰胺标准溶液常用的溶剂是甲醇、乙腈、水、甲醇－水、乙腈－水。试验考查了相同浓度的三聚氰胺在水、甲醇－水（70＋30）、乙腈－水（70＋30）、乙腈和甲醇5种溶剂中的紫外光谱（见图2）。

图2 三聚氰胺标准溶液的紫外吸收光谱Figure 2 Ultraviolet absorption spectral of melamine standard solution

由图2可知，在所考查的5种不同极性溶剂中，三聚氰胺的紫外吸收光谱形状基本一致，吸收峰最大移动仅2nm，说明这5种溶剂对三聚氰胺的紫外吸收的影响较小。但在以水作为溶剂的三聚氰胺谱图中，在203nm与235nm处最大吸收峰强度相对另外4种溶剂较大。因此建议配制三聚氰胺标准使用溶液时以水作溶剂较为合适。

2.2 三聚氰胺在不同流动相中的紫外吸收

三聚氰胺在不同流动相的紫外可见光谱（见图3，流动相同表1）。最大吸收光谱波长主要与分子中共轭双键的长度及生（助）色基团有关。从图3可以看出，用不同流动相溶解三聚氰胺时，三聚氰胺紫外吸收波长有一定的相似性，在236.0nm附近都有吸收。这是因为三聚氰胺－C═N－双键组成的六元环共轭结构，n→π＊跃迁和六元环的振动的重叠引起的，使得其吸收带红移［9－11］。

图3 不同流动相对三聚氰胺紫外吸收光谱的影响Figure 3 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by different mobile phase

由于三聚氰胺目前的检测方法多为液相色谱法，因此需要考查不同色谱流动相中三聚氰胺的紫外吸收光谱，为选择合适的色谱条件提供指导。

2.2.1 不同流动相体系对三聚氰胺紫外吸收的影响 三聚氰胺在不同流动相中的紫外吸收波长不完全相同。这主要分两个体系：① 有柠檬酸的流动相体系；② 无柠檬酸的流动相体系。无柠檬酸的流动相体系基本遵循三聚氰胺各官能团的紫外吸收原则，最大吸收波长在205nm附近。有柠檬酸的流动相体系由于柠檬酸本身的紫外吸收（见图4），使三聚氰胺的低波长吸收峰红移［11］。

图4 柠檬酸和离子对试剂的紫外吸收光谱Figure 4 The infection of ultraviolet absorption spectral of citric acid and different ion reagent

2.2.2 离子对试剂对三聚氰胺紫外吸收的影响 在有柠檬酸体系的流动相中，对不同离子对试剂（相同浓度己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠）对三聚氰胺紫外吸收光谱影响作了研究，发现离子对试剂对三聚氰胺紫外吸收影响甚微（见图5）；同时分别在有柠檬酸的流动相体系中改变庚（辛、己）烷磺酸钠浓度为0.010，0.005，0.001mol／L（见图6），发现其浓度变化对三聚氰胺紫外吸收影响小，仅低波长吸收峰随着离子对浓度的增加发生微小的增色效应。

图5 离子对试剂对三聚氰胺的紫外吸收光谱影响Figure 5 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by different ion reagent

2.2.3 柠檬酸对三聚氰胺紫外吸收的影响 在有柠檬酸体系的流动相中，三聚氰胺的紫外吸收光谱又随柠檬酸浓度发生变化。本试验分别在柠檬酸体系的流动相体系中改变柠檬酸浓度为0.010，0.005，0.001mol／L（见图7）。随着柠檬酸浓度增大，三聚氰胺低波长吸收峰红移程度越大，相对高吸收波长却无明显变化。

另外，还参照文献［11］所提供的色谱条件，有针对性的选取了几个波长，用高效液相色谱法作了比较。当检测波长为203，205，210nm时，有柠檬酸的流动相体系则由于基线干扰非常大，灵敏度低，检测限值高（见图8）；而无柠檬酸的流动相体系则基线平稳，灵敏度高，检测限值低，能达到0.01mg／kg（见图9）；当检测波长为215nm时，各流动相响应相当；当检测波长为236nm和240nm时，各流动相几乎都有相应的响应值，但检测限值最低为2mg／kg。选择适合自己的流动相体系，除检测限外，还应从成本、做样过程中受干扰程度和流动相对仪器影响程度等因素综合考虑。因此，应根据实际情况来选择合适的色谱条件。

图6 离子对试剂浓度对三聚氰胺的紫外吸收光谱影响Figure 6 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by the concentration of ion reagent

图7 柠檬酸浓度对三聚氰胺的紫外吸收光谱影响Figure 7 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by the concentration of citric acid

图8 三聚氰胺色谱图（有柠檬酸的流动相体系，203nm，2mg／L）Figure 8 The chromatogram of melamine（in citric acid mobile phase system，203nm，2mg／L）

图9 三聚氰胺色谱图（无柠檬酸的流动相体系，203nm，2mg／L）Figure 9 The chromatogram of melamine（in non－citric acid mobile phase system，203nm，2mg／L）

3 讨论

从试验的结果可以看出，三聚氰胺在不同流动相中紫外吸收波长是不同的。可见，根据溶解三聚氰胺标准品的某一种溶剂的扫描结果是很难确定三聚氰胺的吸收波长的；况且在色谱分析过程中，通常采用一种以上的溶剂作为流动相，其中的多种小分子与三聚氰胺分子相互作用也会影响三聚氰胺的紫外吸收。这就要求更加全面掌握三聚氰胺在不同流动相中波长的变化，才能找到适合各自色谱条件的检测波长。

综上所述，采用高效液相色谱法测定三聚氰胺含量时，在没有柠檬酸体系的流动相中应采用203nm左右或236nm左右的检测波长；而在有柠檬酸体系的流动相中应采用236nm左右的检测波长。

1 王箴.化工辞典［M］.北京：化学工业出版社，2000.

2 中国国家标准化委员会.GB／T 22388——2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法［S］.北京：中国标准出版社，2008.

3 汪辉，曹小彦，彭新凯，等.高效液相色谱－二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺［J］.食品与机械，2007，23（5）：114～124.

4 汪辉，彭新凯，曹小彦，等.高效液相色谱测定生鲜乳及乳制品中三聚氰胺的方法研究［J］.食品科学，2008，29（10）：531～535.

5 丁涛，徐锦忠，李健忠，等.高效液相色谱－二极管阵列检测法及高效液相色谱－电喷雾串联质谱法测定植物源性蛋白中残留的三聚氰胺［J］.色谱，2008，26（1）：6～9.

6 赖碧清，郑晓航，韩银涛.高效液相色谱－四极杆质谱联用测定饲料中三聚氰胺含量［J］.饲料工业，2008，29（4）：47～48.

7 蒋晨阳，范倩，林德清，等.气质联用法测定饲料中的三聚氰胺［J］.饲料工业，2008，29（8）：48～50.

8 张俊燕，何吕兴.三聚氰胺的样品前处理及最新检测方法［J］.生命科学仪器，2007，5（10）：57～59.

9 杨胜科，张金平，徐永花，等.苏丹Ⅲ在不同溶剂中的紫外可见光谱研究［J］.光谱学与光谱分析，2007，27（2）：325～328.

10 Gilchrist T L.Heterocyclic Chemistry［M］.2nd ed.New York：Wiley，1992.

11 朱明华.仪器分析［M］.北京：高等教育出版社，2000：270～278.

Ultraviolet absorption spectral of melamine in different mobile phase

CAO Xiao－yan1，2PENG Xin－kai1WANG Hui1HU Zhao－hui1LI Ying1XIA Yan－bing2

（1.Changsha Center of Supervision ＆Inspection on Food Quality Safety，Changsha，Hunan410013，China；2.College of Food Science and Technology，Hunan Agriculture University，Changsha，Hunan410128，China）

Ultraviolet absorption spectral of melamine in different mobile phase was studied.The result showed there was different ultraviolet absorption spectral of melamine in different solvents and determination content of melamine in different mobile phase must chose corresponding check wavelength.Finally，wavelength in 203nm or 236nm was chose in none citric acid system and while with wavelength about 236nm in citric acid system.

melamine；mobile phase；ultraviolet absorption spectral；chromatogram

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.04.017

曹小彦（1973－），女，长沙市食品质量安全监督检测中心高级工程师，在读博士。E－mail：caoxiaoye＠163.com

2011－04－01