UPLC－MS/MS法测定乳制品中的氯霉素类药物

任 佳 郑小平 黄菲菲 陈景春 马颖清 楼 飞

（农业部食品质量监督检验测试中心（上海），上海 200436）

UPLC－MS/MS法测定乳制品中的氯霉素类药物

任 佳 郑小平 黄菲菲 陈景春 马颖清 楼 飞

（农业部食品质量监督检验测试中心（上海），上海 200436）

建立超高效液相色谱－串联质谱（UPLC－MS/MS）法测定乳与乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的检测方法。样品经乙腈及乙酸乙酯提取、正己烷脱脂、C18柱净化后，通过超高效液相色谱－质谱联用仪进行检测，内标法定量。各标准溶液在0.1～10μg/L范围内呈线性相关 （r＝0.999），不同基质样品中添加回收率为75%～114%，检出限为0.1μg/kg。结果表明，该方法是一种准确测定乳与乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的检测方法。

氯霉素；甲砜霉素；氟苯尼考；超高效液相色谱－串联质谱；乳与乳制品

氯霉素类药物是一种高效广谱的抗生素，包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等。氯霉素对人体具有毒副作用，能抑制造血机能，引发人体的粒细胞缺乏病、再生障碍性贫血和溶血性贫血［1］。因此，很多国家规定氯霉素的残留限量标准为“零容许量”，即不得检出。中国农业部235号公告规定鲜奶中不得检出氯霉素，甲砜霉素残留限量为50μg/kg。目前，针对水产品、蜂产品、动物组织等基质中氯霉素类药物的检测方法较多，主要有微生物法［2，3］、酶联免疫法［4］、气相色谱法［5，6］、液相色谱法［7］、气相色谱－质谱联用法［8，9］、液相色谱－质谱联用法［10－12］等，但针对乳与乳制品中氯霉素类药物的检测方法较少。乳与乳制品如采用其他方法中较常使用的提取试剂乙酸乙酯直接提取，会发生严重的乳化现象。这是由于蛋白质与脂肪，尤其是脂肪具有乳化性，在进行剧烈震荡提取过程中容易产生乳化现象。乳与乳制品的主要组成包括蛋白质、脂肪、糖类、维生素、无机盐、水分等，这些样品基质的存在不但干扰待测物的检测，而且会污染仪器和降低设备使用寿命，需要重新选择合理有效的提取试剂。UPLC－MS/MS具有快速，高灵敏度和高专一性等特点，不受化学噪声的干扰。本试验利用UPLC－MS/MS，旨在建立一种乳与乳制品中氯霉素类药物的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

牛奶、奶粉、乳清粉：均为市售产品。

1.2 试剂

乙酸乙酯、乙腈：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

正己烷、甲醇：色谱纯，西格玛奥德里奇公司；

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考（标准物）：纯度＞99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

氘代氯霉素（标准物）：100μg/mL，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

混合标准溶液的配制：准确称取适量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考标准物质，用甲醇配成100μg/mL的标准储备溶液。准确吸取1mL标准储备溶液于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，此混合溶液中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考浓度为1.0μg/mL。

氘代氯霉素内标标准溶液配制：准确吸取100μL氘代氯霉素于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。

1.3 仪器与设备

超高效液相色谱－串联质谱仪：Quattro Premie，美国沃特世公司；

氮吹仪：ANPEL DC12，上海安谱科学仪器有限公司；

SPE固相萃取柱：LC－C18，色谱科公司。

1.4 方法

1.4.1 样品准备

（1）液态奶：准确称取5g，置于15mL离心管中。

（2）奶粉、黄油、奶酪、乳清粉等乳制品：准确称取2g，置于15mL离心管中，用5mL水溶解，必要时可加热溶解。

1.4.2 样品中氯霉素类药物的提取 准确吸取氘代氯霉素内标标准溶液50μL于装有样品的15mL离心管中，加入5mL乙腈，涡旋振荡提取1min，以4 000r/min离心5min，上清液转移至100mL烧杯，重复提取2次，合并上清液；加入10mL乙酸乙酯以及5g氯化钠，涡旋振荡提取1min，4 000r/min离心5min，弃下层水，收集的乙腈－乙酸乙酯混合溶液在50℃左右使用氮吹仪吹干；吹干后的提取物分别用4mL水、4mL正己烷溶解后转移至15mL离心管，涡旋振荡1min，以4 000r/min离心5min，弃上清液，用4mL正己烷重复提取1次，弃上清液，下层水溶液备用。

1.4.3 C18柱净化处理 依次用3mL甲醇、3mL水活化，取备用液过柱，弃去流出液，用3mL水淋洗，减压抽干，用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液于离心管中，置于氮吹仪上50℃ 吹至近干，用1mL甲醇－水混合溶液（30＋70）溶解，经0.22μm滤膜过滤，试液供测定。

1.5 色谱和质谱条件

1.5.1 UPLC条件 色谱柱：C18色谱柱，粒径1.7μm，50mm ×2.1mm；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：甲醇＋水 （30＋70）；流速：0.20mL/min。

1.5.2 串联质谱条件 离子源：电喷雾负离子源；检测方式：多反应检测（MRM）；毛细管电压：2.5kV；离子源温度：110℃；脱溶剂气及锥孔气：氮气，流量分别为700，50L/h；碰撞气：氩气；定性离子对、定量离子对及对应的保留时间、锥孔电压和碰撞能量见表1。

2 结果与分析

2.1 线性关系

将混合标准溶液稀释得到浓度为0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0μg/L的标准系列。在规定的色谱条件下进行测定，得到的线性方程见表2。由表2可知，在0.1～10μg/mL范围之内氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考浓度与色谱峰面积响应值之间存在着良好的线性关系。标准溶液的多反应监测（MRM）图谱见图1。表明浓度为0.1μg/L时各标准物质响应值良好。

表1 各标准物质的多反应监测的参考值Table 1 The reference value in multiple reaction monitoring of each standard material

表2 标准溶液回归方程及相关系数Table 2 Regression equation and the correlation coefficient of the standard solution

图1 标准溶液MRM色谱图Figure 1 MRM chromatogram of standard solution

2.2 准确度与精密度试验

选取牛奶、奶粉、乳清粉三类典型样品，进行氯霉素类抗生素添加回收试验，每个水平进行6次平行测定，测定数据见表3。牛奶空白样品及加标回收样品MRM色谱图见图2和图3。

表3 不同样品中平均加标回收率和相对标准偏差（RSD）试验结果Table 3 The recovery and RSDof different samples（n＝6）

图2 牛奶空白样品MRM色谱图Figure 2 MRM chromatogram of milk blank sample

图3 牛奶加标（0.1μg/kg）样品 MRM 色谱图Figure 3 MRM chromatogram of milk standard sample

由表3可知，按已确定的样品提取条件和仪器条件测定添加回收量，其平均回收率达到75%～114%，相对标准偏差＜10%，说明该方法对不同样品、不同含量的氯霉素类药物的测定均有较好的准确度和精密度。由图2、3可知，添加浓度为0.1μg/kg时各标准物质响应值良好，证明该方法灵敏度高，能满足检测条件。

2.3 检出限

根据限量检测要求，对牛奶、奶粉两种典型样品进行氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考加标回收重复试验，见表3。当添加浓度为0.1μg/kg时，信噪比S/N＝6.7＞3，试验结果表明，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考检出限为0.1μg/kg。

3 结论

本试验建立了超高效液相色谱－串联质谱法测定乳与乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的检测方法。采用乙腈、乙酸乙酯提取样品中的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，正己烷去脂，C18柱净化后通过液质联用仪进行检测，内标法定量各标准溶液在0.1～10μg/L范围内呈线性相关 （r＝0.999），区不同基质样品中添加回收率为75%～114%。与其他的检测方法相比，本方法在前处理上，易于操作，可完全消除乳化影响；适用范围广，可适用于乳与乳制品（包括液态奶、乳粉、乳清粉、奶酪等）中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的检测；灵敏度高，检出限可达到0.1μg/kg，完全满足乳制品进出口检测的需要。表明本试验提出的方法能准确测定乳与乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的含量。

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3 宋杰，宋燕青，王勇鑫，等.微生物法在检测牛奶中氯霉素残留的应用［J］.河北师范大学学报，2005，29（1）：85～87.

4 Scortichini G，Annunziata L，Haouet M N，et al.ELISA qualitative screening of chloramphenicol in muscle，eggs，honey and milk：method validation according to the Commission Decision 2002/657/EC criteria［J］.Analytica Chimica Acta.，2005，535：43～48.

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7 戴华，王美玲，李拥军，等.饲料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量的 HPLC 测定方法［J］.光谱实验室，2006，23（6）：1 209～1 212.

8 中华人民共和国农业部渔业局.农业部958号公告－14－2007水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的测定气相色谱－质谱法 ［S］.北京：中国农业出版社，2007.

9 中华人民共和国农业部.农业部781号公告－10－2006蜂蜜中氯霉素残留量的测定 气相色谱－质谱法（负化学源）［S］.北京：中国农业出版社，2006.

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11 蔡欣欣，张秀尧.超高效液相色谱三重四极杆质谱法快速测定动物源食品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留［J］.中国卫生检验杂志，2009，19（2）：258～260.

12 中国标准化管理委员会.GB/T 20756——2006可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱－串联质谱法［S］.北京：中国标准出版社，2006.

Determination of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol residues in milk and dairy products by UPLC－MS/MS

REN Jia ZHENG Xiao－ping HUANG Fei－fei CHEN Jing－chun MA Ying－qingLOU Fei

（Food Quality Supervision and Testing Center of Ministry of Agriculture，Shanghai200436，China）

A method of determination of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol in milk and dairy products by Ultra Performance Liquid Chromatography－Tandem Mass Spectrometry （UPLC－MS/MS）was developed .Samples were extracted with acetonitrile and ethyl acetate，and defatted with hexane.Through clean－up with C18column，Samples were detected by UPLC－MS/ MS.The method had a good linear relativity（r：0.999）between 0.1～10μg/L.Recovery rates in different substrate samples range from 75%to 114%，with LOD of 0.1μg/kg.The method was accurate and suitable for the quantification and confirmation of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol in milk and dairy products.

chloramphenicol；thiamphenicol；florfenicol；UPLC－ MS/MS；milk and dairy products

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.04.020

上海市技术性贸易措施应对专项（编号：2008TBT012）

任佳（1984－），女，农业部食品质量监督检验测试中心工程师，硕士。E－mail：renjia1102＠hotmail.com

郑小平

2011－03－30