多糖免疫受体研究进展

余国庆，陈晓明

（温州医学院 检验医学院、生命科学学院，浙江 温州 325035)

多糖（polysaccharides）是自然界中含量最丰富的生物聚合物，广泛分布于植物、动物和微生物中。研究表明，多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗感染、抗病毒、抗氧化衰老、增强内皮细胞增殖及对细胞氧化损伤的保护修复、促进生长发育、抗辐射、抗凝血、降血糖、降血脂、护肝等多种功能。近年来，多糖的免疫调节作用成为生物化学和生命科学研究的热点。其免疫调节作用首先是通过与细胞表面的受体相结合而介导免疫反应，目前发现的受体主要包括Toll样受体（TLR）、甘露糖受体、Dectin-1、Dectin-2、清道夫受体、补体受体3（CR3）和Lactosylceramide受体 （CDw17）。多糖与这些受体结合后可以激活细胞内信号通路，进而活化免疫细胞，促进细胞因子的释放。现对多糖免疫受体研究进展作一综述。

1 TLR

1996年，发现Toll蛋白作为果蝇抗真菌和细菌感染的模式识别受体，介导天然免疫，能使果蝇分泌多种抗微生物感染的多肽清除病原微生物[1-2]。随后Toll蛋白发现于人的细胞膜上，其胞外区与果蝇Toll蛋白同源而得名TLR[3]。TLR广泛表达在天然免疫系统中，是一类I型跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞质区组成。它们通过识别保守的病原体相关的分子位点（PAMPs），例如细菌的脂多糖、脂肽，或者是细菌和病毒的DNA、RNA等，来识别大量的异己抗原。TLR在固有免疫和引导适应性免疫中扮演着重要的角色。至今至少有10种人类Toll的同源物和13种鼠类的TLR相继被鉴定，对相关的分子结构及其特异性配体，受体与配体之间的识别，以及信号转导通路均有了不同程度的了解[4-6]。TLR家族通过胞外区感应组织中的危险信号，经相应接头蛋白进行信号传导，激活相关的核内基因，从而诱导感染性炎症和非感染性炎症。TLR家族包括细胞表面的TLR（TLR1、TLR2、TLR4/MD-2、TLR5、TLR6和TLR11等）和细胞内TLR（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9等）[7]。根据接头蛋白的不同可分为MyD88依赖性和非MyD88依赖性途径，其中TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR7、TLR9和TLR11介导的信号传导途径为MyD88依赖性，MyD88依赖性途径主要激活促炎症因子的产生，如TNF-α、1L-1β、IL-6等。TLR3介导的信号传导途径为非MyD88依赖性，TLR4则既可为MyD88依赖性亦可为非MyD88依赖性。非MyD88依赖性途径也就是TRIF依赖途径，主要产生IFN-1。

TLR4是第一个在哺乳动物上发现的TLR，位于染色体9q32-33，编码839个氨基酸，其中有22个N端的LRRs，分子量为90 kDa，TLR4表达于许多的免疫和非免疫细胞，其在细胞表面与MD-2牢固结合[8]，活化TLR4将诱导产生一系列的炎症递质包括细胞因子、趋化因子等从而产生强有力的炎症反应。多糖可以通过TLR2和TLR4受体介导再与CD14一起将胞外信号转导至胞内，使NF-κB迅速从胞浆移位到胞核，调节相应靶基因的表达，活化转录，促进细胞因子的释放，从而发挥免疫调节作用[9-12]。Yoon等[13]报道了从桔梗的根中提取的多糖能促进RAW264.7细胞iNOS mRNA的表达，增加NO的产生；同时能刺激C3H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO，但对C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬细胞无明显作用；用TLR4抗体预先与巨噬细胞作用，能抑制桔梗根多糖刺激细胞产生NO；桔梗根多糖能引起IκB降解，使NF-κB迅速从胞浆移位到胞核，促进DNA与NF-κB结合。这些结果表明桔梗根多糖通过TLR4/NF-κB通路途径引起巨噬细胞iNOS mRNA的表达量增加和产生NO。紫云英根多糖能与正常小鼠B淋巴细胞和巨噬细胞表面结合并将其激活，且不能被兔抗鼠免疫球蛋白抑制，紫云英根多糖不能诱导C3H/HeJ小鼠的脾B细胞增殖，这些结果显示紫云英根多糖通过膜免疫球蛋白TLR4受体激活B细胞。同时，紫云英根多糖也不能激活C3H/HeJ小鼠巨噬细胞产生免疫活性，且用TLR4单克隆抗体能部分抑制紫云英根多糖与巨噬细胞的结合[14]。TLR功能性表达于怀孕早期蜕膜，配体刺激后，TLR4、TLR9介导蜕膜分泌TNF-α、IL-6增强，提示TLR参与母胎界面免疫微环境的调节。而黄芪多糖可以通过改变蜕膜TLR介导的免疫功能影响免疫微环境[15]。灵芝多糖中分离的组分Reishi-F3可以通过TLR2/TLR4 受体活化小鼠脾脏B淋巴细胞，上调转录因子Blimp-1表达量，而增加IgM的表达，且与丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、JNK以及NF-κB的活化有关[16]。许文等[17]研究发现猪苓多糖（polyporus polysaccharide，PPS）能促进树突状细胞的成熟，增强树突状细胞活化T淋巴细胞的能力，并通过TLR4促进体外培养的小鼠骨髓树突状细胞表型与功能成熟。同时他们报道PPS对C3H/HeN小鼠的脾细胞增殖、腹腔巨噬细胞产生IL-1β和TNF-α的作用明显强于C3H/HeJ小鼠，流式细胞仪及激光共聚焦显微镜分析结果表明，Flu-PPS与小鼠腹腔巨噬细胞结合的荧光强度显著高于Flu-葡聚糖，200 mg/L抗TLR4单抗可明显阻断Flu-PPS与巨噬细胞的结合，PPS可能通过TLR4活化小鼠腹腔巨噬细胞[18]。

TLR2位于染色体4p31-32，其序列编码784个氨基酸，其中有19个N端LLRs，分子量为84 kDa。TLR2能介导细菌多糖及植物多糖发挥免疫调节作用，如Graveline等[19]报道了猪链球菌的荚膜多糖经过TLR2介导激活巨噬细胞发生免疫作用。Lee等[20]报道创伤弧菌表面荚膜多糖作用于人肠上皮细胞（INT-407）细胞通过TLR2/NF-κB途径产生IL-8，wbpP基因突变的创伤弧菌表面荚膜多糖表达下降，此突变细菌作用于INT-407细胞导致IL-8、TLR2 mRNA表达量及NF-κB活性较正常菌下降，同时用TLR2抗体能明显减少创伤弧菌荚膜多糖作用于INT-407产生IL-8及抑制NF-κB的激活。Lu等[21]发现云芝多糖通过TLR2激活CD8+T细胞及NK细胞而发挥抑制肿瘤生长的作用。

2 Lactosylceramide受体

CDw17是中性粒细胞上一个主要的神经鞘糖脂膜成分，已被确定为β-葡聚糖的受体，但其介导β-葡聚糖的反应机制不是很明确[22]。Wakshull等[23]报道CDw17的特异性单克隆抗体，能够抑制PGG-葡聚糖激活NF-κB-like因子而进行核转移，表明CDw17是PGG-葡聚糖的受体。β-葡聚糖通过细胞表面的神经鞘糖脂CDw17介导人嗜中性粒细胞活化而增强中性粒细胞的抗菌功能。Sato等[24]报道了含有中性鞘糖脂Lactosylceramide的脂质体能完全抑制可溶性念珠菌β-D-葡聚糖（CSBG）引起的中性粒细胞趋化迁移。此外，结合实验显示CSBG能结合末端带有半乳糖残基的鞘糖脂类（如Lactosylceramide）。而且Scr激酶抑制剂蛋白磷酸酶1，磷脂酰肌醇（PI-3K）抑制剂渥曼青霉素和Gαi/o百日咳毒素均能抑制CSBG引起的中性粒细胞趋化迁移。这些结果表明CSBG结合CDw17诱导中性粒细胞迁移是通过Src家族激酶/PI-3K/异源三聚体G-蛋白信号传导路径。Li等[25]报道了光滑假丝酵母能诱导上皮细胞表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。TLR4抗体阻断TLR4不影响GM-CSF的产生，但CDw17抗体阻断CDw17能显著抑制NF-κB的激活和GM-CSF的合成。

3 CR3

CR3（又称Mac-1、αMβ2整合蛋白、CD11b/CD18）是白细胞黏附受体组的重要成员，存在于巨噬细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞表面，它通过促使效应细胞与靶细胞之间的接触增强吞噬作用，因而在免疫调节中具有重要作用。CR3是由两条肽链所构成的膜糖蛋白，它的配体为iC3b。CR3最早在白细胞膜上被发现，所以又称之为白细胞整合素。CR3是中性粒细胞、单核/吞噬细胞、NK细胞激活的标记，同时在激活的CD8+T细胞亚群及树突状细胞膜上也有表达。Yan等[26]报道小鼠巨噬细胞的CR3受体有两个特异结合区域：一个可以与葡聚糖结合，一个可以与iC3b 结合，CR3受体与葡聚糖结合后可促进巨噬细胞对iC3b调理的靶细胞吞噬作用。Vetvicka等[27]报道可溶性β-葡聚糖多糖绑定到吞噬细胞或自然杀伤细胞CR3，不断引发受体针对iC3b的肿瘤组织的细胞毒性作用并使正常组织缺乏iC3b。Baranyay[28]发现补体受体参与碳水化合物的C3受体配体绑定，多糖与其受体的结合具有特异性。Cywes等[29]研究发现非调理素是依赖C3受体与荚膜多糖结合从而识别并结合结核分支杆菌。Muller等[30]发现裂褶菌多糖可以与巨噬细胞系U937表面受体结合，而甘露聚糖、右旋糖酐和大麦葡聚糖不能与之结合，并且裂褶菌多糖的三螺旋结构对这种结合是必须的。

4 C型凝集素受体

C型凝集素受体是模式识别受体中一类重要的家族，具有一个或多个C型凝集素样结构域（C-type lectinlike domains，CTLDs），也即位于C型凝集素受体上，含有序列同源的碳水化合物识别域（carbohydrate recognition domain， CRD）[31]。根据该识别域是否依赖Ca2+可将其分为经典和非经典两大类。而按其受体的结构可分为I型和II型，I型受体含有多个CRDs的跨膜多肽，包括甘露糖受体（MR， CD206）、磷脂酶A2受体、DEC-205（CD205）和Endo180（CD280）等。相比之下II型受体是由单一CRD的跨膜多肽组成，这组受体包括树突细胞表面的特异性细胞间黏附因子3结合非整合素分子（dendriticcell-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin、DC-SIGN、CD209）、胰岛蛋白（CD207）、巨噬细胞半乳糖型凝集素（MGL、CD301）、胶原凝集素、树突细胞相关凝集素1和2（dectin-1和dectin-2）等[32]。目前研究与多糖相互作用的C型凝集素受体主要是甘露糖受体以及dectin-1和dectin-2。

4.1 甘露糖受体 甘露糖受体属于多凝集素受体，是一种相对分子质量为180 000的Ι型跨膜糖蛋白，表达于大部分组织巨噬细胞、内皮细胞和树突状细胞，可识别存在于细胞表面或病原体细胞壁上的多种糖分子，主要通过参与受体介导的内吞作用和吞噬作用，维护机体内环境的稳定，并将非特异性免疫与特异性免疫联系起来，组成机体的一种免疫防御系统。甘露糖受体属于Ca2+依赖凝集素家族，通过CRDs与糖结合[33]。甘露糖受体自身有八个CRDs位于一条多肽链上，其中CRD4和5对糖的结合极为重要，并且结合和摄取多价的配体至少需要一个临近膜的CRD。

Zamze等[34]研究了离体巨噬细胞的甘露糖受体与不同细菌多糖的结合，表明该受体能与肺炎链球菌的荚膜多糖和脂多糖结合而不能和肺炎克雷伯杆菌的荚膜多糖结合。这种结合需要Ca2+的参与，并能被D-甘露糖抑制。甘露糖受体的融合蛋白含有4-7CRD，整个可溶性甘露糖受体表面所有跨膜区都特异性地和细菌多糖结合，表明这4-7个结构域足够识别这些多糖结构。奇怪的是多糖结构域和甘露糖受体结合没有直接的相关性，表明多糖的结构在受体的识别中起到很大作用。Liu等[35]报道，大黄多糖口服或腹腔注射均能具有明显治疗结肠炎作用。大黄多糖可明显地升高结肠炎大鼠腹腔巨噬细胞甘露糖受体的活性和吞噬能力，能显著抑制甘露糖受体与甘露糖的结合及巨噬细胞吞噬甘露糖的能力。大黄多糖能显著升高健康大鼠巨噬细胞IFN-γ的分泌，甘露糖不影响细胞因子的分泌，但可以显著抑制大黄多糖引起的IFN-γ分泌水平，表明大黄多糖治疗结肠炎的免疫调节可能由甘露糖受体介导。郭振军等[36]的进一步研究表明大黄多糖引起巨噬细胞分泌TNF-α作用是通过甘露糖受体介导，而当归多糖的作用也与甘露糖受体有关。许多中药多糖富含甘露糖或葡萄糖组分，且以反复串联的结构存在，与甘露糖受体具有比抗体更高的结合特性[37]，如壳寡糖可通过与巨噬细胞表面的甘露糖受体结合，产生白介素 -1β和 TNF-α[38]。

4.2 Dectin-1 2001年Gordon等[39]使用富含β-葡聚糖的酵母聚糖筛选巨噬细胞系的cDNA文库后得到一种新的葡聚糖受体即Dectin-1。Dectin-1是一种模式识别受体，在抗真菌天然免疫中发挥着重要作用。 Dectin-1是吞噬细胞表面对β-葡聚糖特异性的受体，树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞（如肺泡巨噬细胞和炎性巨噬细胞）、中性粒细胞均能广泛表达β-葡聚糖受体[40]。β-葡聚糖是由β-（1，3）、β-（1，4）和/或β-（1，6）糖苷键连接的葡萄糖多聚体，广泛存在于燕麦、大麦、海藻、毛霉菌、孢子丝菌、酿酒酵母真菌等。其在真菌中是真菌细胞壁产生的葡萄糖聚合物，如酿酒酵母和白色念珠菌的细胞壁产生的酵母多糖， Dectin-1先结合在针对β-葡聚糖介导的活性氧，激活NF-κB后产生促炎细胞因子。 酵母聚糖主要由β-葡聚糖、甘露聚糖、甘露糖蛋白和甲壳素组成，通过Dectin-1与TLR2协同介导发生免疫反应[41]。

Dectin-1是二型跨膜蛋白，分子量大约28000 Da，特征与其他免疫受体一致，可转导感染与C型凝集素样CRD处由秸秆连接的跨膜区域，然后细胞浆里包含一个基于酪氨酸酶激活基序的免疫受体（ITAM）。Dectin-1可以识别含有β-（1，3）和β-（1，6）糖苷键的葡聚糖，并诱使其自身信号通路[40-41]，在与配体结合后，Dectin-1是由非受体酪氨酸激酶Src磷酸化，Syk被激活并诱导CARD9-Bcl10-Malt1复合体活化，该复合体介导NF-κB激活和炎症细胞因子的产生，形成介导吞噬作用和介导NADPH氧化酶产生活性氧类的胞内信号，产生杀菌作用。最新数据表明，TLR介导NF-κB的信号，转导并产生炎性细胞因子，这些反应可被Dectin-1增强。同样，TLR信号转导还可以增强Dectin-1激发的活性氧类产生。Dectin-1和TLR2/TLR6 通路相结合并加强每个受体引起的反应[41-44]。

Masuda等[45]从舞耳当中提取的多糖MZ-Fraction（klasma-MZ）是一种β-葡聚糖，分子量很小，大约在20000，由β-（1，3）和β-（1，6）糖苷键结合而成。能在体外诱导小鼠巨噬细胞J774A1的抗原递呈和产生TNF-α和IL-12，并在体内表现出抗肿瘤活性。酵母多糖可以和Dectin-1结合，可以被真菌、植物、细菌来源的β-葡聚糖抑制，而其他聚合物如纤维素和甘露聚糖没有抑制效果[46]，同时研究发现β-葡聚糖抗肿瘤、抗感染活性还依赖于多糖自身的理化性能。人们还需要进一步的研究，以明晰Dectin-1和β-葡聚糖的特异性，从而阐明β-葡聚糖免疫调节机制。

4.3 Dectin-2 Dectin-2最初是从小鼠朗格汉斯细胞样细胞系XS52中发现，被认为为朗格汉斯细胞特有的C型凝集素，随后从树突状细胞以及巨噬细胞中检测到有表达[47-48]。Dectin-2分子含有一个EPN序列（Glu-Pro-Asn）和一个钙离子依赖性CRD，能够识别甘露糖结构的碳水化合物，其特异性配体是高甘露糖结构[49]。Dectin-2在细胞浆缺乏一个已知信号区域，因为Dectin-2在它的跨膜区缺乏精氨酸，而精氨酸对于含有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）信号分子如Fc受体c（FcRc）链或者是DNAX激活蛋白12（DAP12）的膜组织十分重要，目前该信号传导机制尚不清。研究表明Dectin-2与FcRc链的结合是通过Dectin-2胞浆区域的精氨酸残基[49]。当甘露糖刺激FcRc链基因缺陷小鼠时，不能产生细胞因子，表明Dectin-2的生物学功能需要FcRc链的存在[50]。

Dectin-2能够识别α-甘露聚糖，并通过与免疫受体酪氨酸抑制基序包含的FC受体γ链结合完成细胞信号的转导。结合以后免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）结合脾激酶酪氨酸激酶激活胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9），使NF-κB转移到细胞核当中，最终激活TNF-α和白介素-1在内的多种细胞因子的表达，介导机体的免疫应答[51]。使用多糖点阵检测发现，Dectin-2能和许多种物种包括真菌当中含有高甘露糖的结构结合[49，52]。最近有研究用白色念珠菌细胞壁甘露聚糖刺激Dectin-2基因缺陷小鼠的骨髓来源细胞完全不能产生细胞因子表明Dectin-2是甘露聚糖的功能性受体[50]。从A型白色念珠菌中提取甘露聚糖由α-1，6-链多聚甘露糖连接到精氨酸残基与α-1，2-链寡甘露糖基侧链[51，53]。然而，缺乏β-甘露聚糖的细胞壁甘露聚糖与自然的假丝酵母甘露糖刺激小鼠骨髓来源细胞释放细胞因子效果相同，但不能引起Dectin-2缺乏的树突状细胞产生细胞因子，这些表明β-甘露聚糖不参与Dectin-2与假丝酵母菌甘露聚糖的识别[50]。Dectin-1和Dectin-2对真菌感染的免疫调节途径见图1。

图1 Dectin-1和Dectin-2对真菌感染的免疫调节[51]

5 清道夫受体

清道夫受体是表达于巨噬细胞表面的一类模式识别受体，能识别细菌和真菌细胞壁多糖和脂质，介导吞噬作用。分为多种类型，主要为SRA和SRB，还包括SRC等。SRA为三聚体缠绕的糖蛋白跨膜分子，各带有5个不同的结构域。其中胶原样结构域可结合修饰过的脂蛋白，并由富含赖氨酸的分子束组成携带正电荷的结合槽，接纳带负电荷的配体，包括多聚核糖核苷酸（如PolyG和poly1）、多糖（如LPS和脂磷壁酸）和阴离子磷脂（如缩醛磷脂酰丝氨酸），以及氧化型和乙酰化的低密度脂蛋白（oxLDI、acLDL）等。SRB中的一个主要成员为CD36，分子质量为88 kDa，表达于血小板、单核/巨噬细胞及内皮细胞。其配体为血小板反应蛋白、胶原蛋白、磷脂及氧化型低密度脂蛋白。

Shnyra等[54]报道脂多糖在体外结合肝枯否细胞和内皮细胞是通过清道夫受体途径。清道夫受体可结合多种配体，在巨噬细胞清除病原体、宿主防御以及信号转导过程中发挥重要作用[55]。Nakamura等[56]研究发现，褐藻聚糖能通过清道夫受体使野生型小鼠腹腔巨噬细胞激活并释放NO，且NO的释放量与褐藻聚糖呈剂量依赖关系。褐藻聚糖作用于清道夫受体基因敲除（SR-/-）的小鼠腹腔巨噬细胞时并不能诱导细胞分泌NO，表明褐藻聚糖通过清道夫受体途径激活巨噬细胞。p38 MAPK和NF-κB抑制剂能够抑制褐藻聚糖刺激巨噬细胞产生iNOS，从而减少细胞上清中NO的量。实验结果表明褐藻聚糖能够通过与清道夫受体相结合而进一步激活细胞内p38 MAPK和NF-κB两条信号通路，促进巨噬细胞释放NO。

6 结语

多糖的免疫作用机制的调节受体已发现以上几种，但是目前仍然停留在表面阶段，有待于进一步深入研究。由于多糖结构的多样性和复杂性，可以想象，多糖受体也是多样的，今后还将会有更多的多糖受体被揭示。多糖的作用机制将会更加明了，为开发多糖药物以及多糖药物应用于临床治疗提供实验依据和理论基础。

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