大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

方海田，周运佼，谢希贤，陈 宁

(1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 宁夏大学农学院，银川 750021)

大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

方海田1,2，周运佼1，谢希贤1，陈 宁1

(1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 宁夏大学农学院，银川 750021)

为解决胞苷生物合成途径中天冬氨酸氨甲酰转移酶受胞苷三磷酸反馈抑制调节的问题，通过对其碱基序列和蛋白质结构分析，利用基因定点突变的方法构建了大肠杆菌的 ATCase突变酶，得到三个突变体：M1(H20L)、M2(K60E)、M3(K94E)，并在E. coli DH5α中对融合蛋白进行了表达.酶活测定表明，M1、M2、M3的ATCase酶相对活性都比野生型M0的高，分别为野生型M0的1.10、1.22和1.37倍，且比活力都有不同程度提高.与含野生型pyrBI基因的 M0相比，含突变型基因的 M1、M2和 M3均对 15,mmol/L的 CTP具有强的抗反馈抑制作用，且 M1、M2和M3的抗CTP反馈抑制作用分别是M0的5.4、6.0和8.5倍.最后将各突变质粒转入到E. coli Cyt10(Δcdd)中进行发酵培养，结果表明，与未含突变基因菌株相比，各含突变基因菌株的胞苷积累量均有不同程度的提高，说明 ATCase定点突变使胞苷的合成积累途径得到了不同程度的强化.

大肠杆菌；胞苷；天冬氨酸转氨甲酰酶；定点突变；抗反馈抑制

目前胞苷的生产主要采用发酵法[1]，利用基因重组技术构建产胞苷的基因工程菌，通过改变发酵条件积累胞苷，而解除天冬氨酸氨甲酰转移酶的反馈抑制调节作用是发酵法生产胞苷的关键问题之一.天冬氨酸氨甲酰转移酶(aspartate transcarbamylase，ATCase，EC 2.1.3.2)是一种调节酶，由 pyrBI基因编码，催化氨甲酰磷酸和天冬氨酸形成氨……