固相萃取-液相色谱/串联质谱法测定黄酒中的甜蜜素

胡贝贞，宋伟华，董文洪

（绍兴出入境检验检疫局，浙江绍兴 312000）

固相萃取-液相色谱/串联质谱法测定黄酒中的甜蜜素

胡贝贞，宋伟华，董文洪

（绍兴出入境检验检疫局，浙江绍兴 312000）

建立了黄酒中甜蜜素残留的固相萃取-液相色谱/串联质谱法（SPE-LC/MS/MS）测定方法。黄酒样品用水稀释后，弱阴离子（WAX）固相萃取小柱净化，氨化甲醇洗脱。采用Hypersil Gold C18色谱柱（150mm×2.1 mm，5 µm），乙腈－0.1%甲酸水溶液为流动相，以电喷雾离子源负离子模式（MRM）定性、定量测定甜蜜素。甜蜜素在10～500µg/L范围内峰面积与质量浓度呈线性关系，相关系数为0.999 5。取有代表性的阴性样品进行添加回收试验，在 0.5～5.0mg/L 范围内，回收率为 81.1%～88.2%，相对标准偏差为 3.65%～5.21%，方法的定量检测限为 0.5 mg/L。该方法净化效果好，检测灵敏度高，能同时完成黄酒中甜蜜素的定量和定性分析。

固相萃取；液相色谱串联质谱；黄酒；甜蜜素

甜蜜素（Sodium Cyclamate）的化学名为环己基氨基磺酸钠，是一种人工合成的水溶性、高甜度且价格低廉的甜味剂。甜蜜素在我国广泛用于食品加工行业，但其超量、超范围使用现象严重［1］。过量摄入甜蜜素有致癌、致畸、损害肾功能等副作用，目前日本、美国、英国等40多个国家禁止将甜蜜素作为食品甜味剂。根据GB 2760-2011《食品添加剂使用卫生标准》规定，甜蜜素不得用于除配制酒以外的酒类中，而黄酒属于发酵酒，在禁用食品之列。黄酒是我国出口的大宗酒类产品之一，其中出口黄酒有很大部分销往日本市场，而日本已于1969年禁用甜蜜素。为了保障国内外消费者的权益，建立黄酒中甜蜜素准确、可靠的分析方法有着重要意义。

目前测定甜蜜素的方法主要有气相色谱法［2-4］、气质联用法［5-7］、液相色谱法［8，9］、离子色谱法［10，11］等。其中常用的方法为在酸性条件下用亚硝酸钠将甜蜜素衍生成环己基亚硝酸酯再供气相色谱测定，如文献［2，3］，但酒中固有的环己醇、环己基类化合物会产生假阳性结果，该方法不适合酒类产品中甜蜜素的检测；第2种常用的方法为在酸性条件下用次氯酸钠将甜蜜素衍生成N，N-二氯代环己基胺再供液相色谱或气质联用测定［5,8］，该方法虽不会产生第1种方法中的干扰，但笔者在几年的实际应用中发现液相紫外法在衍生产物N，N-二氯代环己基胺出峰处有杂质干扰，灵敏度较差，检出限高，且无法进行阳性确证，气质联用法虽然能进行阳性确证，但需要衍生化，操作繁琐，检测灵敏度不理想。

近年来，有不少LC-MS-MS用于甜蜜素检测的报道，如文献［12-14］，该方法无需衍生，检测灵敏度高，但存在的问题是无样品前处理过程，LC-MS-MS易受基质干扰而存在严重的离子抑制效应，导致定量不准确；此外，较脏的样品极易引起离子传输管污染，导致仪器维护频繁，所以在检测基质复杂的样品时，这些方法的应用受到限制。

黄酒样品基质复杂，无法采用直接进样法分析，笔者根据甜蜜素的结构特点，应用Waters弱阴离子（WAX）交换小柱进行样品前处理，净化效果好，弥补了上述方法的不足，适合复杂基体样品中甜蜜素检测的前处理。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪：TSQ Quantum Acess三重四极杆型，美国Thermo Fisher公司；

纯水发生器：Elix5型，美国M illipore公司；

超纯水器：SYNERY型，美国M illipore公司；

甜蜜素标准品：纯度99%，德国Dr.公司；

Oasis WAX弱阴离子交换固相萃取小柱：60mg/（3 m L），美国Waters公司，使用前分别用3 m L甲醇、3 m L 2%（体积分数）甲酸溶液预活化；

乙腈、甲醇、甲酸：色谱纯，美国TEDIA公司；

尼龙微孔过滤头：孔径0.22 µm，北京振翔公司；

甜蜜素标准储备液：1 000mg/L，准确称取200mg标准品于200m L容量瓶中，用超纯水定容至刻度。使用时用超纯水稀释至合适的浓度。

实验用水为超纯水。

1.2 仪器分析条件

（1）液相色谱条件

色谱柱：Hypersil Gold C18色谱柱（150mm×2.1 mm，5 µm）；柱温：25℃；流动相：0.1% 甲酸溶液 -乙腈（体积比为80︰20），等度洗脱；流速：200µL/min；进样量：10µL。

（2）质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：3 000V；雾化气（高纯氮气）：137 894 Pa；辅助气（高纯氮气）：34 473 Pa；碰撞气（高纯氩气）：0.2 Pa；甜蜜素母离子：m/z 178.0，子离子 m/z 80.2 ；碰撞电压：27 V。

1.3 样品处理方法

取1 m L黄酒，用超纯水稀释至25 m L，取1 m L加入到已活化好的WAX小柱上，重力过柱，然后分别用3 m L 2%（体积分数）甲酸溶液、3 m L甲醇淋洗，真空抽干，用3 m L 5%（体积分数）氨化甲醇洗脱，洗脱液于45℃水浴中氮吹至干，用1.0m L超纯水定容，过0.22 µm滤膜，滤液供液质联用分析。

2 结果与讨论

2.1 流动相条件的优化

比较了乙腈-水体系和乙腈- 0.1%甲酸体系，发现乙腈-水作为流动相时，甜蜜素的离子化效率很低，没有检测目标物峰，而在体系中加入0.1%的甲酸后，离子化效率大大提高，质谱效应较好，检出限满足要求。通常在电喷雾正离子模式下，化合物母离子常为［M+H］+，为了提高离子化效率，需要加入甲酸、乙酸等作供质子体，而本实验负离子模式下化合物母离子为［M-Na］+，理论上无需加入甲酸等，而实际发现不加入甲酸甜蜜素根本无法出峰，而加入甲酸后则能获得很好的响应，在负离子模式下测定其它母离子为［M-H］+的物质时也存在这一现象。

实验考察了不同体积比的乙腈- 0.1%甲酸体系对峰形的影响，分别在体积比20︰80，30︰70，50︰50时采集谱图，由峰形对比发现随着乙腈含量的增加，甜蜜素的峰形渐渐变差，这是由于甜蜜素是完全离子化的溶于水的物质，随着流动相中有机相的增加，互溶性变差，导致峰形变差。实验选择乙腈- 0.1%甲酸体积比为20︰80，等度洗脱，在该条件下甜蜜素峰形和灵敏度较好。图1为20µg/L的甜蜜素标准溶液的色谱图。

图1 L甜蜜素标准溶液色谱图

2.2 定容液的选择

实验发现，用流动相定容时，当标准溶液的浓度稍微高一些时，甜蜜素的峰形变差，出现“馒头峰”，而用纯水定容时则能获得较好的峰形和响应，图2和图3为200µg/L标准品分别用流动相和纯水定容时的色谱图。由图2和图3可知，浓度较高的甜蜜素标准溶液未能完全溶解在含一定比例乙腈有机相的流动相中，而能完全溶于纯水中。为保证高浓度溶液的峰形和响应值，拓宽标准曲线的线性范围，实验选择纯水为定容液。

图2 200µg/L标准品用流动相定容时的色谱图

图3 200µg/L标准品用纯水定容时的色谱图

2.3 净化条件的选择

尝试采用水稀释后直接进样，发现虽然谱图上显示杂质干扰不大，但是黄酒中含有大量的色素、糖、有机酸等，这些物质在稀释后的样品中含量很高，若不经净化去除而直接进入仪器系统，容易造成仪器的污染，方法的耐用性受到限制，因此实验选择固相萃取法以达到净化的目的。

甜蜜素是完全电离的盐，分子结构中含有磺酸基负离子基团，实验采用Waters公司生产的WAX弱阴离子交换小柱净化。这种小柱在酸性条件下填料表面电离带正电，能吸附带负电的环己基氨基磺酸基负离子，可吸附目标物，在碱性条件下填料表面不带电，可对目标物进行洗脱。预先采用3 m L 2%（体积分数）甲酸溶液活化小柱，使填料带上正电，能吸附带负电的氨基环己基磺酸基负离子，而后依次用2%（体积分数）甲酸溶液、甲醇清洗柱子，去除水溶性和其它溶于有机溶剂的杂质，最后用5%（体积分数）氨化甲醇淋洗小柱，使小柱填料呈电中性，将目标物洗脱下来。采用WAX小柱净化后，谱图基线有所下降，而大量杂质在净化过程中被去除，使方法的耐用性大大提高。

2.4 线性方程、回收率、精密度及定量限

将标准储备液用纯水稀释成 10，50，100，200，500µg/L的系列标准工作溶液，进样分析，以响应值Y为纵坐标，浓度X（µg/L）为横坐标绘制标准曲线，线性方程为 Y=1 520.36X+8 260.55，r2＝0.999 5。同时取阴性黄酒样品，分别添加 5.0，2.0，0.5 mg/L 3个浓度的标准品，每个浓度做5个平行样品，考察回收率和精密度，结果见表1。以回收率和精密度都能获得较理想数据的浓度点作为定量限，本方法定量限为 0.5 mg/L。

表1 回收率及精密度试验结果（n=5）

3 结语

建立了黄酒中甜蜜素的固相萃取-液相色谱/串联质谱分析方法，方法净化效果好，耐用性强，适合日常大批量样品的检测，满足产品中目标物的定性和定量要求。

［1］王骏.液相色谱-质谱联用测定食品中微量甜蜜素［J］.食品科技，2008，33(9):239-241.

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［3］孔祥健，冯亮.毛细管气相色谱法测定乳制品中的甜蜜素［J］.现代食品科技，2011，27(6):723-726.

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［5］沈伟健，黄娟，沈崇钰，等.气质联用法测定含蛋白食品中的甜蜜素［J］.分析试验室，2007，6(6):93-95.

［6］姜文良，钱玉根，杨民.GC-MS法测定黄酒中的甜蜜素［J］.中国食品添加剂，2008(5):156-158.

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Determ ination of Sodium Cyclamate in Rice W ine by Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography-Tandem M ass Spectrometry

Hu Beizhen，Song Weihua，Dong Wenhong
(Shaoxing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shaoxing 312000，China)

A solid phase extraction -liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for determ iantion of sodium cyclamate was developed. The rice w ine sample was diluted w ith ultra pure water，purified w ith WAX SPE coulmn，eluted w ith ammoniated methanol，then the sodium cyclamate in the sample was detected by LC-MS-MS in MRM mode using Hypersil Gold C18column（150mm×2.1 mm，5µm） and acetonitrile-0.1% formic acid as mobile phase.The sodium cyclamate mass concentration was linear w ith peak area in the range of 10-500µg/L, w ith the correlation coeffi cient of 0.999 5. The recoveries of sodium cyclamate spiked in samples at three levels ranged from 81.1% to 88.2%w ith the relative standard deviation of 3.65% -5.21%(n=5). The lim it of quantification was 0.5 mg/L. The method is sensitive and it can simultaneously complete quantifi cation and qualitation analysis of sodium cyclamate in rice w ine.

SPE; LC-MS-MS; rice w ine; sodium cyclamate

O657.7+2

A

1008-6145(2012)01-0055-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.017

联系人：胡贝贞；E-mail:hubeizhen_002@yahoo.com.cn

2011-11-16