益生菌Gan－1的鉴定、理化特性及其降胆固醇作用

刘秋，钟世期，刘长健，闫建芳，于基成

（大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116605）

益生菌Gan－1的鉴定、理化特性及其降胆固醇作用

刘秋，钟世期，刘长健，闫建芳，于基成

（大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116605）

从啤酒样品中分离出一株具有较强的耐酸、耐盐、耐胆盐及降胆固醇能力的细菌菌株Gan－1。利用多相分类方法，即通过形态特征、生理生化特性以及16S rRNA核酸序列分析，鉴定出菌株Gan－1为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei Gan－1）;采用MRS－Broth培养基，模拟人体胃酸环境、渗透压环境和胆盐环境，测定在酸性及高胆盐环境作用下菌株Gan－1的生长状况。结果表明，菌株能够耐受pH3的环境、低于6%NaCl的高渗环境以及低于2.0%的胆盐环境;菌株具有降解胆固醇的能力，培养至24 h时，降解的胆固醇达24%。

干酪乳杆菌;耐酸;耐胆盐;降胆固醇

干酪乳杆菌（L.casei）是一种益生菌，能够耐受口腔中的酶、胃液中的低pH值酸和小肠的胆汁酸等，可以在肠道内大量存活，并能起到调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收等作用。此外，干酪乳杆菌具有降低胆固醇、诱导其自身产生抗菌素、促进细胞分裂和产生抗体免疫及抗癌等特性。

1 材料与方法

1.1 仪器

TC－512 Thermal Cycler PCR仪（Techne，英国）;凝胶成像系统（UVP，美国）;J2－MC型高速冷却离心机（Beckman，美国）。

1.2 培养基

NBB培养基（购买于德国柏林）;PYG培养基:参照文献［1］;改良MRS培养基（100 mL）:胰蛋白胨1 g、牛肉浸膏0.8 g、酵母浸膏0.4 g、麦芽糖3.5 g、醋酸钠0.5 g、吐温80 0.1 mL、柠檬酸三铵0.2 g、磷酸氢二钾0.2 g、硫酸镁0.02 g、硫酸锰0.005 g、pH5.7±0.2;高胆固醇培养液MRSO－CHOL:参照文献［1］。

1.3 菌株的分离及筛选

自啤酒发酵液中通过滤膜过滤（0.02 μm），采用NBB培养基厌氧分离培养7 d，分离获得编号为Gan－1的菌株，经纯化后保存至含0.3%牛胆盐的MRS培养基中备用。

1.4 菌株的鉴定

1.4.1 形态特征观察

将菌株Gan－1在35℃恒温下培养24 h，进行形态特征观察。

1.4.2 菌株Gan－1的DNA提取及16S rDNA序列分析

菌体Gan－1 DNA的提取方法见参考文献［2］，菌株基因组的扩增、产物回收、重组连接、转化及阳性克隆筛选均参照文献［3］，引物为F27:5＇＞AGAGTTTGATCCTGGCTCAG＜3＇;R1492:5＇＞TACCTTGTTACGACTT＜3＇。测序委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成。所得16S rDNA序列在Genbank数据库中与已知细菌16S rDNA序列进行同源性比对，利用MEGA4软件构建系统进化树，并将菌株16S rDNA序列提交Genbank进行注册。

1.4.3 菌株Gan－1的生化特性

辣椒不同种质资源种子萌发期耐盐性评价………………………………………… 高晶霞，颜秀娟，吴雪梅，谢 华，王学梅（102）

对菌株Gan－1分别进行糖发酵产酸试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、精氨酸水解试验、明胶液化试验、淀粉水解、硝酸盐水解等生理生化测定［4］。

1.5 菌株Gan－1的耐酸试验

配制菌株Gan－1的菌悬液（106 cfu·mL－1，以下同），按2%（体积比）的接种量接种至不同pH的MRS－Broth培养基中，35℃静置培养12 h，于600 nm下测定OD值。

1.6 菌株Gan－1的耐盐试验

按2%（体积比）的接种量接种至含不同浓度氯化钠的MRS－Broth培养基中，35℃静置培养12 h，于600 nm下测定OD值，测定菌株的耐渗透压性。

1.7 菌株Gan－1的耐胆盐试验

按2%（体积比）的接种量接种至添加不同浓度的牛胆盐MRS－Broth培养基中，35℃静置培养12 h，于600 nm下测定OD值。

1.8 菌株Gan－1的降胆固醇试验

按1%（体积比）的接种量接种至MRS－胆盐－胆固醇培养基中，厌氧35℃培养20 h，然后离心除去菌体。上清液中的胆固醇含量采用邻苯二甲醛法测定［6］。培养基中原有的胆固醇量与上清液中胆固醇量的差值为胆固醇的沉淀量。

2 结果与讨论

2.1 菌株Gan－1的鉴定

2.1.1 形态学鉴定

将分离纯化菌种在35℃恒温下培养24 h，菌株gan－1的菌落形态为圆形，直径1.0～3.5 mm，隆起，湿润，乳白色，不透明;菌体形态为圆端分节的杆状，多数为C型2～9节，少数10节以上，宽0.1～1.5 μm，长4.1～6.4 μm，集聚成团或平行叠加（如图1）;革兰氏染色阳性，无芽孢，兼性厌氧。

图1 菌株Gan－1的形态（×40）

2.1.2菌株Gan－1的生化特性

将菌株Gan－1与乳酸杆菌属的模式菌株进行生理生化特性比较，由测定结果可知，菌株Gan－1的H2O2酶试验、V－P试验、吲哚试验、明胶水解、淀粉水解、精氨酸水解、硝酸盐利用、H2S试验均为阴性，与干酪乳杆菌（L.casei）的生理生化特性基本一致。但是，从糖利用试验结果可知，菌株Gan－1可利用麦芽糖和蔗糖作为碳源，这与干酪乳杆菌（L.casei）模式菌株有所差异。

2.1.3 菌株Gan－1的16S rDNA序列分析

菌株Gan－1的16S rDNA PCR基因扩增结果如图2，扩增出1 600 bp左右的目的基因片段;利用BLAST搜索软件将菌株Gan－1的16S rDNA序列测序结果与GenBank数据库中相关菌株的16S rDNA序列进行比对，比对结果表明，菌株Gan－1与Lactococcus lactis，L.casei以及L.paracasei subsp paracasei同源性均达到99%。

图216 S rDNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

2.2 菌株Gan－1的耐酸试验

人体消化道正常pH值范围为2～8，胃液pH值随饮食结构的变化波动很大，通常pH值为3.0。本文选择4个不同pH值进行测试。人体消化过程约需4 h，而食品通过胃的时间相对较短，一般为1～2 h，因此设定培养时间为4 h。菌种活化至活菌数约2×108cfu·mL－1，而活菌发挥功能特性的菌数临界值为106cfu·mL－1，因此将经酸作用后活菌对数下降小于2作为耐酸性标准［7］。试验结果如图3。菌株Gan－1在pH值为3.0条件下，2 h后活菌数由108cfu·mL－1降至107cfu· mL－1，4 h后活菌数仍在106cfu·mL－1以上;在pH值为2条件下，2 h后活菌数降至105cfu· mL－1，4 h后活菌数降至104cfu·mL－1。由此可以看出，菌株Gan－1耐受pH值为3的酸性环境。食物摄入2 h后通过胃到达肠道。该菌株耐受胃酸，可以通过胃进入肠道发挥作用。

图3 耐酸试验结果

2.3 菌株Gan－1的耐盐试验

菌株Gan－1在不同渗透压下的耐受结果如图4。由图4可知，菌株Gan－1在含6.0%NaCL的培养基中仍能生长，说明其耐渗透压的效果很好。

图4 耐盐试验结果

2.4 菌株Gan－1的耐胆盐试验

人体不同部位的胆汁酸的浓度不同。胆汁酸盐含量为0.3%～0.5%、胆盐含量为0.3%是衡量菌株耐受人体肠道胆汁酸的标准。耐酸试验（pH3）中，菌株Gan－1在2 h后通过胃到达肠道，活菌数降至3×107cfu·mL－1，因此耐胆盐试验接种量设定为3×107cfu·mL－1。食物通过肠道的时间约2～3 h，设定培养时间4 h。试验结果如图5。菌株Gan－1在0.3%胆盐环境下活菌数有所下降，但3 h后活菌数仍在106cfu·mL－1以上，高于活菌发挥功能特性的菌数临界值。菌株Gan－1对不同胆盐的耐受性没有显著差异。由此表明，所筛选菌株具有一定的抗胆汁盐能力，可顺利通过小肠到达大肠。

图5 耐胆盐试验结果

2.5 菌株Gan－1的降胆固醇试验

在0.3%胆盐含量下测定菌株Gan－1的降解胆固醇能力，试验结果如图6。在24 h内，菌株Gan－1生长状态良好，胆固醇的降解率也逐步升高，至24 h时，降解的胆固醇达24%。

图6 不同时间培养液中胆固醇降解率

3 结论

干酪乳杆菌（L.casei）相关菌株是经长期验证对人体无毒副作用，且广泛用于保健食品生产的益生菌。关于干酪乳杆菌的分类地位一直多有争议，本文利用16S rDNA核酸序列比对分析中，菌株Gan－1与乳酸乳球菌（L.lactis）、副干酪乳杆菌亚种（L.paracasei subsp paracasei）、干酪乳杆菌（L.casei）亲缘关系均较近，但乳酸乳球菌细胞呈球形或卵圆形，与菌株Gan－1的菌体形态差别较大。Dellagio等根据可溶性蛋白电泳图谱分析和DNA－DNA同源性分析，取消了副干酪乳杆菌亚种（L.paracasei subsp paracasei）的名称，将其合并为L.casei。本文将菌株Gan－1与L.casei的模式菌株的形态特征、生理生化特性进行了比较分析，二者在糖源利用上存在一定的差异，菌株Gan－1可利用麦芽糖和蔗糖作为碳源，因此将菌株Gan－1鉴定为L.casei的一个亚种。

活菌含量106cfu·mL－1是菌株发挥降胆固醇功能特性的菌数临界值。胃酸和胆盐具有抗菌作用，乳酸杆菌被食入后不仅要通过恶劣的胃液，还要抵抗来自胰腺的胆盐。因此耐酸、耐胆盐特性是乳酸杆菌作为功能性食补因子的重要指标之一，并由计算得出pH值为3、胆盐为0.3%是衡量菌株耐受人体胃肠道的标准。本文模拟人体胃肠环境，以菌株的初始接种量为2×108cfu· mL－1，经耐酸、耐胆盐连续试验，活菌数仍在106cfu·mL－1以上，表明有足够数量的菌株Gan－1通过胃肠道而保持活性，发挥降胆固醇的益生作用。

目前干酪乳杆菌（L.casei）多从乳制品中获得，对开发功能性乳制品具有重要意义。而菌株Gan－1是从啤酒样品中分离获得，其不仅对营养的需求更为简单，同时其较高的活性也使该菌株不仅应用领域更宽泛，并可用于食品的防腐保鲜。实验结果表明，该菌株同样具有耐酸、耐胆盐和降解胆固醇的能力，可作为益生菌的备选菌株，但需要保证食品中一定的活菌数目。

［1］刘丽莉，董铁有，杨协立.6种乳酸菌降解胆固醇的体外试验［J］.河南科技大学学报，2005，12（6）:85－88.

［2］朱炳林，张茜茜，方维焕.瑞士乳酸杆菌HZ521株的分子鉴定及其部分生物学特性研究［J］.动物医学进展，2009，30（2）:49－52.

［3］张刚.乳酸细菌基础、技术和应用［M］.北京:化学工业出版社，2004.

［4］胡书芳，王雁萍，洪爱俊，等.自然发酵酸菜中乳酸菌的分离鉴定及其生理特性研究［J］.安徽农业科学，2009，37（15）:6896－6898.

［5］靳志强，王延祥，李平兰，等.植物乳杆菌耐酸耐胆盐的体外试验及其降胆固醇作用［J］.中国食品学报，2009，10（5）:24－28.

［6］剧柠，王晓兰，李泽，等.乳酸菌降胆固醇作用研究现状［J］.微生物学通报，2009，36（1）:125－129.

Identification，Physico－chemical Characteristics of Strain Gan－1 and its Effect of Cholesterol Reducing in Vitro

LIU Qiu，ZHONG Shi－qi，LIUChang－jian，YAN Jian－fang，YU Ji－cheng
（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China）

A strain Gan－1 which has the strong resistant ability for acid，salt，and bile salt and the good cholesterol reducing was screened from beer samples.The morphological，physiological，biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence of the strain Gan－1 were analyzed.Then the strain Gan－1 was identified as Lactobacillus casei Gan－1 by polyphasic taxonomy method.By stimulating human gastric acid and intestinal bile salt condition，the viability of Gan－1 strain during exposure to acid MRS broth，high salt MRS broth and bile salt MRS broth were determined，respectively.Then the bile salt hydrolase activity of Gan－1 strain，degradation of bile salt and cholesterol precipitation were measured in this bile salt concentration.The results show that the strain Gan1 has tolerance capability to the pH=3，6%salt and 0.3%bile salt environment and can reduce cholesterol.In MRS medium with cholesterol，strain Gan－1 degrades 24%of cholesterol.

lactobacillus casei;acid resistant ability;bile salt resistant ability;cholesterol reduction

Q935

A

1009－315X（2012）03－0198－04

2011－12－06;最后

2011－12－20

国家自然科学基金项目（31070005）;中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（DC10030102，DC10030102）。

刘秋（1969－），女，辽宁大连人，教授，博士，学校优秀学术带头人主要从事微生物学研究。

（责任编辑 邹永红）