Zn2+及Fe3+对嗜淀粉乳杆菌开放式发酵产乳酸的影响

邹 惠,汪群慧,刘建国,王 爽(北京科技大学环境系,北京 100083)

乳酸是重要的生物化工产品,广泛用于医药、食品、饮料、日用化工、化工、石油化工、皮革、卷烟工业等领域.其异构体合成的L-乳酸聚合物,可生产能生物降解的农用地膜及其他塑料制品,可有效解决全球的“白色污染”问题,因此,乳酸有广阔的国内外市场[1].

嗜淀粉乳杆菌是一种具有淀粉水解活性的乳酸细菌,它产生的解淀粉酶具有淀粉酶和支链淀粉酶双重活性,可以直接转化复杂的淀粉质底物生成乳酸[2-4].餐厨垃圾是一种淀粉含量较高的有机废物,其淀粉含量达到 41.38%～55.09%(按干重计),嗜淀粉乳杆菌的加入将有利于简化糖化等生产工艺,故此类细菌在乳酸发酵工业上应用广泛[5-7].传统乳酸发酵方式采用灭菌式的非开放式发酵,这种发酵会消耗大量电能,采用不灭菌的开放式发酵是一种理想的发酵方式[8].目前微生物发酵过程中存在着产酸率低,微生物对原料的利用率低,容易累积产生其它非目标产物,生产周期长等问题.锌离子、铁离子等微量元素可影响细胞内关键性酶活,当底物中Zn2+浓度大于1.748mg/L或Fe3+的浓度达到0.204mg/L时,培养基中的乳酸菌生长良好,乳酸的积累量将大大增加[9-10].本课题组在前期实验基础上,采用在开放式发酵过程中引入代谢调控物的方法,研究微量元素对乳酸发酵的影响,旨在突破产酸量低的瓶颈.

1 材料与方法

1.1 菌种

嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus GV6),购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心.

1.2 餐厨垃圾

取自北京科技大学鸿博园食堂,挑去骨头、塑料袋等不可降解物后,垃圾中主要包括米饭、蔬菜、肉、蛋、豆腐、面条等.保存于-20℃的冰箱内待用.其成分如表1所示(按干重计)

表1 餐厨垃圾成分表(%)Table 1 Composition of kitchen waste (%)

1.3 培养基

MRS培养基.121℃灭菌15min备用.

1.4 发酵方法

150g粉碎后的垃圾加入 75mL水,装入500mL具塞玻璃瓶中(非开放式发酵在 121℃灭菌15min),通入高纯氮气生成厌氧环境,按接种量2g(菌体湿重)/L(餐厨垃圾培养基)接入嗜淀粉乳杆菌(菌龄24h),37℃下发酵96h.

1.5 分析方法

取样后 4000 r/min离心 15min,上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后测定.液相色谱选用日本岛津公司高效液相色谱仪LC-20AT.

有机酸测定[11]为色谱柱:预柱 C185μm×26mm,分析柱 Inertsil ODS-SP 5um C186mm×250mm,检测器UV 210nm,柱温40℃,流动相超纯水(pH值为2.5～3.0),流速0.8mL/min.糖浓度测定[12]:分析柱为 Inertsil NH25um 250mm× 4.6mm,检测器示差检测器,柱温 40℃,流动相75%乙腈+25%超纯水,流速1.0mL/min.采用峰面积外标法定量,得到各种浓度.乙醇含量的测定:利用 SBA-40C型生物传感器进行测定.乙醇脱氢酶,乳酸脱氢酶测定[13]:乳酸脱氢酶是在催化丙酮酸转化乳酸的同时,将NADH氧化成NAD,使得NADH在340nm处的吸光度不断降低,因此连续测定酶反应过程中340nm处吸光度的变化即可算出酶活.酶活单位定义为25℃时,每min氧化1umol的NADH所需的酶量;而乙醇脱氢酶是把丙酮酸转为乙醇的关键性酶活,其大小是在340nm处检测 NAD+的还原速度.酶活力单位定义为每min催化1umolNAD+还原需要的酶量.酶活力的计算公式为

式中:VT为反应总体积,mL;VS为样品体积,mL;△A为每min吸光度的降低值.

将样品置于冰浴中,200W 功率超声波破碎20min,10000r/min离心 15min,除去细胞残片,即得到粗酶液.每个样品取5个平行.

2 结果与讨论

2.1 利用嗜淀粉乳杆菌开放式发酵餐厨垃圾产乳酸的可行性

在发酵 96h后,2种发酵体系的发酵液色谱图极其相似,说明他们的组成相差不大多,主要为乳酸、乙酸、甲酸及酒石酸.在开放式发酵下,乳酸产量最高值22.8g/L,占总有机酸的87.2%,而非开放式发酵下乳酸最大值仅为14.8g/L,占总有机酸的 71.5%,较开放式发酵乳酸产量低得多.推测在开放式发酵中,垃圾中存在各种代谢类型的微生物,使淀粉、纤维素等大分子得到不同程度的降解,提高了发酵液中乳酸细菌可利用的小分子化合物的含量,从而使乳酸产量增加[14],而且开放式发酵不需灭菌,节省了大量能源,故以后的实验均采用开放式发酵.

2.2 Zn2+及 Fe3+对开放式乳酸发酵中的相关酶活及代谢产物的影响

2.2.1 Zn2+及 Fe3+对发酵过程中乳酸产量的影响 在乳酸发酵过程中,乳酸菌经过糖酵解途径(EMP)利用糖后产生中间产物丙酮酸,此后丙酮酸的代谢决定了终产物的不同.为了获得高产量的乳酸,最理想的是丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下产生乳酸,如反应式(1)所示,而在实际过程丙酮酸可能会在乙醇脱氢酶(ADH)的作用下被还原生成乙醇,如反应式(2)式(3)所示,也有可能产生丙酸,丁酸等副产物,因此为提高乳酸产率,需在提高乳酸脱氢酶活性的同时,控制副产物的生成,即降低乙醇脱氢酶等的活性[15].

分别在餐厨垃圾培养基中加入0.02m mol/L ZnSO4×7H2O,0.01mmol/L Fe2(SO4)3,考察 Zn2+, Fe3+对嗜淀粉乳杆菌开放式乳酸发酵的影响由图1可见, Fe3+的添加乳酸产量高达29.5g/L,较添加 Zn2+及空白样(添加任何微量元素)的乳酸产量提高了 48.3%,29.4%,且添加 Fe3+的乳酸发酵L-乳酸纯度为90.1%,而添加Zn2+及空白样的L-乳酸纯度分别为 82.7%,84.5%,这表明 Fe3+能促进乳酸发酵,Zn2+却相反.

图1 三种发酵体系中乳酸产量随发酵时间的变化Fig.1 The influence on lactic acid under different microelement

2.2.2 Zn2+及 Fe3+对乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶酶活的影响 Zn2+,Fe3+是维持很多酶和转录因子功能的微量元素.它们对细胞的生长、发育和分化起至关重要的作用.锌离子主要作为细胞蛋白、核酸、碳水化合物和脂类的共因子存在,通过调节锌离子可影响细胞反应.

从图2可知,添加Zn2+在整个发酵过程中抑制了乳酸脱氢酶的活性,却提高了乙醇脱氢酶的活性,且在 48h时,ADH活性达到最大值 10.75 U/mg;相反,添加 Fe3+却抑制了乙醇脱氢酶的活性,提高了乳酸脱氢酶的活性,且在发酵进行 48h后达到最高值11.87 U/mg,这间接说明在体系中添加 Fe3+能加快嗜淀粉乳杆菌积累乳酸.两种离子的添加造成不同的结果,原因是Zn2+不是LDH的激活剂却是ADH的激活剂,故其提高ADH的活性,降低了LDH的活性[16].

图2 三种发酵体系中LDH和ADH随发酵时间的变化Fig.2 The influence on LDH and ADH of microelement

加 Zn2+体系中乙醇脱氢酶(ADH)活性的提高,导致了乙醇的含量的增加(图3和图2b),而加Fe3+体系却相反,它增加了乳酸脱氢酶(LDH)的活性而提高了乳酸的产量(图1和图2a).

图3 不同微量元素条件下乙醇含量随发酵时间的变化Fig.3 Variations of ethanol under different microelement

2.2.3 Zn2+及 Fe3+对发酵过程中 pH 值的影响 从图 4可知,大量乳酸的产生使体系中氢离子浓度增高,进而使得pH值逐渐降低,添加Fe3+的发酵体系pH值降得最低,约为3.39,这也能间接地反映其乳酸产量较其他2种条件下较高.当发酵进行 60h后,pH值基本不发生变化,与此结果相对应,图2中LDH及加Zn2t体系的ADH也呈下降趋势,说明过低的pH值抑制酶活性.

图4 三种发酵体系中pH值随发酵时间的变化Fig.4 Variations of pH under different microelement

2.3 Zn2+及 Fe3+对餐厨垃圾发酵过程中淀粉利用率的影响

从图5可知,添加Fe3+的条件下,淀粉的利用率最高,发酵 84h后,淀粉含量由 46.12%降至17.34%,较添加Zn2+及未添加微量元素时利用率分别提高了 38.5%,28.1%.说明 Fe3+的加入的确能提高淀粉的利用率.

图5 三种发酵体系中淀粉利用率随发酵时间的变化Fig.5 Variations of starch under different microelement

2.4 嗜淀粉乳杆菌开放式发酵过程中糖组分的变化

添加 0.204mg/L Fe3+并接种嗜淀粉乳杆菌2g/L于餐厨垃圾中,在发酵37℃进行开放式发酵,其发酵过程中各种糖组分浓度的变化如图 6 所示.其中,葡萄糖,果糖,麦芽糖浓度先升高后降低,这可能是由于体系中存在的多糖降解成低糖,低糖最后被乳酸菌利用生成乳酸.发酵后期几种糖浓度略有升高,这是乳酸积累到一定程度后其浓度对发酵进行反馈抑制的结果[17],而在整个过程中乳糖的产量很少,且较难被乳酸菌利用.

图6 加Fe3+体系各种糖浓度随发酵时间的变化Fig.6 Variations of sugar concentrations added with Fe3+

图7 蔗糖、麦芽糖及乳糖的浓度随发酵时间的变化Fig.7 Variations of sucrose, maltose and lactose

一般葡萄糖,果糖等单糖能直接被乳酸菌利用生产乳酸[2],为弄清楚二糖(蔗糖、麦芽糖及乳糖)的糖代谢途径,将蔗糖,麦芽糖及乳糖作为单一基质分别代替 MRS培养基中的葡萄糖,灭菌后在37℃下厌氧发酵48h,分析这三种糖被转化利用的情况(图7).图7与图6的结果类似,蔗糖,麦芽糖以及乳糖在发酵过程中会转变成葡萄糖,果糖,最终被嗜淀粉乳杆菌利用,且麦芽糖和乳糖被降解的速度极大于乳糖.

3 结论

3.1 接种嗜淀粉乳杆菌的餐厨垃圾开放式发酵体系所产乳酸量高于非开放式发酵体系.这可能是由于大量土著菌的存在,促进了餐厨垃圾中的高分子有机物水解成乳酸菌容易利用的低分子糖类物质.

3.2 Fe3+的加入能提高乳酸脱氢酶活性,抑制乙醇脱氢酶活性,使淀粉利用率和乳酸产量均高于对照体系,且能更好抑制其他有机酸的产生;而加Zn2+体系的乙醇脱氢酶(ADH)活性较高,导致副产物乙醇产量的增加,从而使淀粉利用率与乳酸产量低于对照体系.

3.3 在嗜淀粉乳酸菌的发酵体系中,二糖中的蔗糖和麦芽糖很容易降解成单糖(葡萄糖和果糖),从而被乳酸菌利用;而乳糖降解成单糖的速度缓慢.

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