微生物聚羟基脂肪酸酯的应用新进展

陈国强

(清华大学生命科学学院，北京100084)

微生物聚羟基脂肪酸酯的应用新进展

陈国强

(清华大学生命科学学院，北京100084)

生物制造产业系包括生物燃料、生物材料和生物化学品的产业，近来也称为“白色生物技术”。由于国内外对有关不依赖于石油原料、环保以及二氧化碳减排和可再生资源的利用等产业的重视，生物制造产业得到了快速发展的机会。聚羟基脂肪酸酯(简称PHA)拥有优良的生物可降解性、生物相容性和光学性能，是当今生物制造的重点之一。经过数十年的努力，PHA已经成长为一个包括工业发酵、环保材料、生物燃料和医用植入材料等的产业链。综述了聚羟基脂肪酸酯的应用新进展及国内发展现状。

聚羟基脂肪酸酯;生物制造;环保材料;PHA

1 前言

石油资源的日渐枯竭和环境的高污染是当经社会发展的两大核心制约因素，日益受到各国政府的高度关注。因此，具有不依赖于石油原料、环保低碳和可再生性等特点的生物制造产业得到了快速发展的机会。生物制造产业包括生物燃料、生物材料和生物化学品等产业，近来也被称为“白色生物技术”。目前开发的重点集中在下列领域:① 生物燃料:从纤维素获得生物燃料乙醇、从生物废弃物获得生物燃气(甲烷)和氢气;②生物材料:生物聚酯如聚羟基脂肪酸酯PHA和聚乳酸PLA等;③生物化学品:如平台化学品包括乳酸、琥珀酸、1，3-丙二醇、3-羟基丙酸等。

生物聚酯——聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一种典型的“低碳材料”。它来源于吸收了二氧化碳的植物，形成后可以作为塑料使用，使用后可以转化为燃料HAME，燃烧后放出的二氧化碳进行光合作用转化为植物，植物又可以作为PHA发酵原料，如图1所示。由于具有优异的生物可降解性、生物相容性和可再生性，PHA已成为当今生物制造领域研究和产业化的重点之一。迄今，研究者对于PHA的合成途径、代谢工程、材料性能和应用等方面进行了系统的研究。国内外相继建立了与PHA大规模生产相关的20几家公司(表1)。PHA和相关技术正在形成了一个从发酵、材料、能源到医学领域的工业价值链。

图1 低碳材料PHA的绿色循环Fig.1 Schematic diagram of green recycle for low carbon materials PHA

表1 全球生产和研究PHA的公司Table 1 Global PHA research and production companies

在国内各级机构支持下，在几个五年计划和863计划支持下，我国在PHA研究的各个领域近年来取得众多研究成果，相关产业也得到大力发展［1］。目前，国内已形成了8个PHA生产企业，总产能超过1.5万t，提供了国际市场上所有PHA类型，使我国在PHA产业化的种类和产量方面都处于国际领先地位。下面具体对国内外PHA的应用新进展和国内发展现状进行分析讨论。

2 PHA简介

PHA由含有羟基的脂肪酸单体组成，单体的羧基与相邻单体的羟基之间形成酯键，分子结构如图2所示。其中，R可以是烷基、烯基、带有苯环的烷基、甚至是带有卤素的烷基等等。R可以从一个C到12个C不等。另外，根据单体结构的规律性，PHA还可以分为PHA均聚物(Homopolymers)、PHA随机共聚物(random copolymers)或PHA嵌段共聚物(block copolymers)等。这些不同的结构给PHA带来了许多热力学性能，可以满足一些列不同的应用。

2.1 PHA结构和分类

PHA具有150多种单体结构［2］，其中包括含有3～16个C原子的各种饱和、非饱和、直链或支链的3-羟基、4-羟基、5-羟基、6-羟基脂肪酸，具有脂肪族或芳香族的侧链，也可能具有甲基、卤原子、羟基、环氧基、氰基、羰基、苯基、苯腈基、硝基苯基和酯化羰基等取代基［3］。

图2 PHA结构通式Fig.2 PHA general molecular structures

根据PHA的单体组成，可将其大致分成以下3类:单体组成在3～5个C原子的PHA称为短链PHA(scl-PHA:short chain length PHA);单体组成在6～16个C原子的PHA称为中长链PHA(mcl-PHA:medium chain length PHA);由短链和中长链单体共聚形成的短链中长链共聚 PHA(scl-mcl-PHA)［4］。

按照单体单元的连接方式不同，PHA可大致分为3类:①只含有一种单体的均聚PHA(homopolymer);②由两种或者更多种单体单元随机聚合而成无规共聚PHA(random copolymer);③主链由两个或两个以上的链段构成，且每一链段只含有一种单体单元的嵌段共聚PHA(block copolymer)［5］。

2.2 PHA的性能

PHA的材料学性质主要是由其单体组成和单体比例决定。依结构单元的组成不同，PHA具有从硬的晶体到软的弹性体等一系列不同聚合物的性质。短链PHA大多数有比较高的结晶度，表现出硬而强的塑料特性;而中长链PHA由于结晶度很低，表现出软而韧的弹性体特征。除了热塑性之外，PHA还具有生物可降解性，生物相容性，疏水性、光学异构性、压电性等特殊性能［6］。

与传统石化塑料相比，PHA的最大优势就是其环境降解性。PHA的环境降解主要在微生物分泌的胞外酶作用下进行，影响PHA环境降解速率的因素很多:从外部条件来看，主要有环境类型，微生物种群及活力、水分、温度等方面;从材料自身性质来看，影响其降解速率的因素主要有PHA的分子结构、聚集态结构、材料宏观形态、第二组分，如添加剂和共混的聚合物等［7］。

2.3 PHA的微生物发酵生产

PHA 由微生物大规模发酵生产，迄今为止，数种PHA，包括聚-3-羟基丁酸酯(PHB)、3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚物(PHBV)、3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚物(P3HB4HB)、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物(PHBHHx)及中长链PHA(mcl PHA)均实现大规模生产(表2)［1］。PHA的生产包括菌种复苏、摇瓶优化、初级发酵实验及工厂级放大发酵。PHA的有效微生物生产取决于几个因素，包括最终细胞密度、细菌生长速率、PHA在细胞干重中的百分比、达到最高细胞密度所需要的时间、底物和产物间的转化效率以及底物价格及提纯PHA的方法。在PHA生产技术的开发不同阶段，必须考虑以上的因素。

此外，针对于特定的用途，PHA还应该有合适的性能，这些性能包括合适的分子量、由单体结构和组成及PHA生产条件共同决定的机械性能和热力学性能等。基因工程，分子进化，合成生物学及PHA生产条件操控等技术，被大量地应用于生产具有特异结构和超高分子量的PHA。野生型细菌和重组细菌均用于各种PHA的大规模生产(表2)［1］。对于大规模应用来说，PHA生产成本必须足够低，否则，PHA无法进入市场。

表2 用于PHA实验或大规模生产的野生菌株和工业化菌种Table 2 Wild type and industrial strains used for pilot or large scale PHA production

3 PHA的应用

3.1 PHA作为生物燃料的应用

张晓军等研究者发现，PHA包括PHB和mcl PHA可分别通过酸水解催化转化为R-3-羟基丁酸甲酯(3HBME)及中链羟基甲酯(3HAME)(图3)。研究显示3HBME和3HAME的燃烧热分别为20 kJ/g和30 kJ/g。乙醇的燃烧热为27 kJ/g，加入3HBME或 3HAME后，可分别将乙醇的燃烧热提升为30 kJ/g和35 kJ/g。在正丙醇和正丁醇中加入3HBME或3HAME后，可导致燃烧 热 的 轻 微 降 低。3HBME/柴 油，3HBME/汽 油，3HAME/汽油等混合燃料的燃烧热低于汽油柴油等纯燃料，但作为燃料来说是合理的。粗略估计，由废水和活性淤泥等为原料的PHA制得的生物燃料的生产价格约为1 200$/t［8］。包括酒精和生物柴油在内的生物燃料，始终存在“粮食或者燃料”及“燃料或者耕地”等争论，而源于废水和活性淤泥的PHA生物燃料的生产，是具有废水处理和能源生产双重功效的过程。这也使PHA在能源方面的应用开辟了新的领域。

图3 PHA甲酯化降解生成生物燃料3HBME和3HAMEFig.3 Biofuels 3HBME and 3HAME derived from methyl esterification of PHA

3.2 PHA作为生物可降解塑料的应用

最初，德国的Wella AG公司使用PHA制作日常用品及包装材料。PHA也被P＆G、Biomers、Metabolix及其它的一些公司开发为包装膜，主要用于购物袋，集装箱和纸张涂料和一次性的用品，例如剃面刀，器皿，尿布，女性卫生产品，化妆品容器和杯子及医疗器械手术服，家居装饰材料，地毯，包装袋和堆肥袋等［1］。

PHB纤维具有高抗张强度，可经在玻璃化温度附近等温结晶制得。延长PHB纤维等温结晶的时间可导致最大拉伸比的降低。当同温结晶的时间延长至24 h以上时，PHA纤维的抗张强度显著提高［9－10］。低分子量的拉伸纤维的抗张强度大于高分子量的。等温结晶化处理后再进行拉伸的PHB具有导向性的α晶体形式和平面之字形的β晶体结构。Vogel等在熔融纺丝过程中，尝试利用过氧化氢进行反应挤出。他们成功地提高了材料的结晶度并阻止了纤维中的二次结晶。这些加工方法克服了PHA的脆性，生产出机械性能更强的PHA纤维。通过向PHB结构中掺入不同摩尔分数的4HB，3HV或者中长链单体获得的共聚PHA，其韧性和弹性获得大幅度提高(表3)，具有更广阔的应用前景。

表3 PHA与传统聚合物塑料性能的比较Table 3 Comparison of PHA and conventional plastics regarding properties

3.3 PHA作为医用植入材料的应用

研究者对 PHB，PHBV，P3HB4HB，P4HB，聚-3-羟基辛酸P3HO(poly-R-3-hydroxyoctanoate)和PHBHHx等PHA材料在缝线、修复装置、维修补丁、绷带、心血管补丁、骨科针、防粘连膜、支架、引导组织修复/再生设备、关节软骨修复支架、神经导管、肌腱修复装置、脊髓支架、人造食道及伤口敷料等方面的应用进行了开发［11］。美国波士顿的Tepha公司专门研究心包补片，动脉增强，心脏支架，血管移植物，心脏植入物和补片，缝合线，辅料剂，隔离粉和药物等。他们的P4HB以PHA4400为名字作为医用材料进入市场［12］。近期研究显示，PHBHHx因其良好的压电性而被成功地用于促进骨骼再生。研究者对于PHBHHx在神经损伤的修复和人工血管方面的应用也加以开发(图4)［13］。此外，研究者还发现PHA的寡聚物具有营养和治疗的功效［14］。

Shishatskaya等人发现，在长于1年的试验期中，PHB和PHBV单纤维缝合没有造成植入区的体内任何不良反应，在对于PHBHHx的研究中也发现了类似的现象［15］。PHBHHx的最重要的性质之一是作为植入生物材料是无毒、无免疫刺激特性，而且其降解产物包括单体和低聚物，甚至激活Ca离子通道并促进受损组织再生［16］。美 国 Tepha公 司 以 P4HB 为 原 料 生 产 的TephaFLEX®可吸收缝合线产品于2007年获得美国食品与药品管理局(FDA)的美国上市批准。更多PHA生物材料将很快进入临床试验。因为PHA材料的多样性，人们可以期望PHA成为一个具有丰富用途的生物植入材料家族。

图4 PHBHHx电纺丝膜和神经导管支架的SEM像:(a)PHBHHx纳米纤维，(b)PHBHHx神经导管Fig.4 SEM images of PHBHHx electric spinning films and its neuron conduits:(a)PHBHHx nanofibers and(b)PHBHHx neuron conduit

3.4 PHA作为手性单体的生产和应用

如果细胞在C源限制培养条件下生长，所积累的PHA可降解为单体，可作为C源和能量来源被细菌重新利用，也可用于产生PHA单体［17］。随着越来越多的新的PHA单体的被发现，PHA已经成为获得手性化合物的新来源。

各种光学纯的(R)-3-羟基烃酸(R-HA)可以通过解聚生物合成的PHA很方便的制得。PHB在添加二氯乙烷和甲醇的条件下，经不同催化反应条件可化学降解生产(R)-3-羟基丁酸(R-3HB)或(R)-3-羟基丁酸甲酯［18］。Roo等通过水解假单胞菌生产聚羟基链烷酸酯制备手性的(R)-3-羟基烃酸和(R)-3-羟基烃酸甲酯［17］。他们首先水解回收醇解后的PHA，然后蒸馏3-羟基烃酸甲酯混合物，分成几个组分。随后，将(R)-3-羟基烃酸甲酯皂化产生相应的羟基烃酸，RHA的最终产量高达92.8%。

Lee和同事证明，R-3HB可以在有效地通过提供适当的环境条件后，在体内产生的解聚合作用下产生。他们在针对Alcaligenes latus的研究中发现，降低pH值至3～4，能诱导细胞内的PHB解聚酶达到最高活性，并且阻止了细胞重新利用(R)-3HB［19］。Ren等将恶臭假单胞菌素细胞悬浮在不同pH值磷酸盐缓冲液中。当pH值为11，降解和单体释放速率最高。在这种条件下，(R)-3-羟基辛酸(R-3HO)和(R)-3-羟基己酸 (R-3HHx)在培养9 h后降解的效率超过90%，相应单体的产量也超过90%。在相同条件下，相比于饱和单体，不饱和单体的降解产率较低［20］。

PHA来源的单体RHA含有手性中心及两个易于修改的功能团(－OH和－COOH)。因此，RHA的一个重要的应用是作为单体合成高分子材料，并作为合成精细化学品如抗生素，维生素，芳烃和信息素的起始原料［21］。

最常见的PHA单体成员，即(R)-3HB已被用作生产碳青霉烯类抗生素和大环内酯的原料。(R)-3HB一个最大的优点是，人类对它具有良好的耐受性，其在体内半衰期短。因此，(R)-3HB可直接用作口服药物。最近，(R)-3HB已应用于治疗失血性休克，大面积烧伤，心肌损伤，脑缺氧及帕金森等。(R)-3HB能降低人类因老年痴呆症和帕金森神经元细胞模型的死亡率，能改善角膜上皮糜烂。此外，研究发现(R)-3HB能显著改善小鼠的记忆［22］。

(R)-3HB对于体外成骨细胞的生长有积极的促进影响，并可用于体内骨质疏松症的治疗。我们的研究结果发现，(R)-3HB能增加血清碱性磷酸酶活性和钙沉积，降低血清骨钙素，防止骨密度降低，从而提高股骨最大载荷和骨变形抗力，以及改善骨小梁体积［23］。

到目前为止，大多数PHA单体应用的开发，基于来源充足的(R)-3HB。若其他的手性单体有了充足的来源，那么新的手性(R)-3HA的医疗应用将迅速出现。这是一个很有潜力的领域。

3.5 利用PHA合成机制提高微生物的适应性

有许多关于PHA生理功能的报道，主要是围绕如Ca源缺乏、干燥、紫外线辐射、高渗透压和存在有机溶剂等生存不利的条件下提高存活能力。

另据报道，有能力积累PHB的细菌更适应突然增加的底物浓度。最近，Zhao等人比较了PHBHHx产生菌嗜水气单胞菌A.hydrophila 4AK4及其相应PHBHHx合成酶PhaC突变菌株(称为A.hydrophila CQ4)的生存能力［24］。清华大学的研究结果发现，野生型的4AK4可提供更好的抵抗环境压力，包括冷热处理，过氧化氢，紫外线辐射，乙醇处理，高渗透压等。实时聚合酶链反应研究表明，PHBHHx的合成可提高γροS编码的Sigma因子表达水平。因此，有可能利用PHA来改进一些工业微生物的耐受性。

此外，PHA合成消耗大量的乙酰辅酶A和NADH，可用于调节某些微生物的代谢，促进产物形成。例如，兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicus是一个生产化妆品透明质酸的重要菌株。当R.eutropha的PHB合成基因phbCAB转入兽疫链球菌中时，重组菌只产生40 g/L的乳酸和7.5 g/L的透明质酸，而野生型产生了65 g/L的乳酸和5.5 g/L的透明质酸［25］。本研究成功证明，与PHA合成有关的能源和C源代谢，可应用于调节其他代谢产物的途径。

Han等人分析和比较了大肠杆菌在PHB合成和非PHB合成条件下的抗性蛋白质生成情况［26］，为PHA的合成与增强抗逆性有关的分子提供了证据。当分析重组菌株的蛋白质二维电泳图时发现，3个热休克蛋白Gro-EL，GroES和DanK在有PHB的积累时显著上调。积累的PHB也诱导了其他与抗性蛋白有关的基因的加强表达。这很好地说明了引入PHA的合成加强了大肠杆菌抗逆性，有助于提高菌株的耐受性。

以上研究结果清楚地说明，PHA的合成能提高非PHA生产菌株的抗压能力，相关的合成机制可借用来改善在不断变化的包括温度、pH值、底物类型和浓度等环境压力下工作的非PHA生产菌的生产能力。

3.6 PHA颗粒表面蛋白的应用

图5 胞内PHA颗粒结构示意图Fig.5 Structural schematic diagram of a PHA intracellular granule

几种蛋白质被发现位于胞内PHA颗粒的表面(图5)［27］。在这些蛋白质中，PHA合成酶可以通过其N-末端与β-半乳糖苷酶融合，实现与β-半乳糖苷酶共价固定在PHA微球上。同样，无论是PHA解聚酶的底物结合域，还是其他PHA合成调节酶PhaF或PhaP(PHA颗粒相关蛋白)的N-末端结构域，都可以被用来把融合蛋白锚定在PHA微球上。已证实 PHA合成调节蛋白PhaR有两个不同的结果域，分别与 DNA和PHB结合［28］，PhaR可以吸附于各种疏水性聚合物，如PHB，PLA，聚乙烯PE和聚苯乙烯等。这种吸附主要是非特异性疏水作用。Banki等开发出了一种以菜豆凝血素和目标蛋白之间自我裂解的内含融合为基础的新型重组蛋白纯化系统，融合蛋白对细胞自身产生的PHB微粒有亲和力［29］。通过收集吸附有重组蛋白的PHB颗粒，内含自我剪切酶导致重组蛋白的释放。这个PHB蛋白纯化系统应用便捷和廉价。

王芝辉等利用一种pH诱导的自剪切内含子和PHA纳米颗粒开发出了一种新型蛋白质纯化方法(图6)。产生靶蛋白的基因和内含子与PhaP是融合的，这些基因在胞内共同过表达。重组大肠杆菌产生的含有目的蛋白及内含子和PhaP的融合蛋白，通过细菌溶解过程与所有其他大肠杆菌的蛋白质一起释放。然后在体外吸附到表面疏水的聚合物纳米粒上。吸附有融合蛋白的微米或纳米粒子，经离心浓缩，然后纯化的目的蛋白被自我剪切的内含子释放，通过一个简单的离心过程与微米或纳米粒子分离。该系统已成功地用于生产和纯化增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、麦芽糖酶结合蛋白(MBP)和β-半乳糖苷。此方法使低成本生产和纯化高附加值的蛋白成为可能［30］。

图6 一种基于pH诱导的自剪切内含子和PHA纳米颗粒和颗粒结合蛋白的新型蛋白质纯化方法:(a)结构示意图，(b)蛋白纯化流程Fig.6 A protein purification method based on pH induced intein and PHA granule binding proteins:(a)structure illustration and(b)flowsheet of protein purification

4 国内PHA产业发展现状

我国在PHA领域的研究在世界范围内是最活跃的，特别是清华大学和中科院。基础研究的活跃开展，进一步促进了我国PHA产业的发展，这就解释了我国目前具有世界最多的PHA产业化企业的原因。

我国在研究、开发和应用可持续发展的环境友好生物材料已经奠定了坚实的基础，包括长春应用化学研究所、清华大学、天津大学和山东大学等单位，在聚羟基脂肪酸酯PHA领域的研发工作以及国内业已形成1.5万t PHA的生产能力，这为PHA产业链的形成做好了技术和物质储备(图7)。特别是最近天津国韵生物材料公司与荷兰DSM公司等合作投资2 000万美元建立一个1万t的PHA的工厂，目前产能仅次于美国Metabolix和ADM合作在建的5万t工厂。

除了在产业化方面取得成功之外，在国家自然科学基金的支持下，我国还克隆了20个以上与生物聚酯PHA合成有关的基因，合成了15种非传统的PHA材料，开发了PHA加工成形的工艺技术。同时，在植物体系也成功地表达了一种聚酯。在“九五”期间，我国在天津、浙江、江苏和广东分别进行了PHA材料的中试和工业化生产，取得了宝贵的产业化经验。目前在山东、江苏、浙江和天津正在进行产业化生产基地的扩大建设，总产能将超过10万t。

在专利方面，至2009年底国内外有关PHA的专利共881个，其中我国拥有64个，清华大学占其中21个。

图7 PHA产业链Fig.7 PHA industrial value chain

5 结语

聚羟基脂肪酸酯PHA具有与传统石化塑料如聚乙烯、聚丙烯等类似的材料学性质，同时PHA可由碳水化合物、脂肪酸等可再生资源合成，并且在环境中可以完全降解进入自然界生态循环，因此被认为是一种环境友好的“绿色塑料”，具有替代传统不可降解塑料的前景。PHA多种的单体结构，产生材料性能的多样性:从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体，因而比其他生物可降解材料具有更广阔的应用领域。PHA材料由于具有良好的组织相容性，可用于医用植入材料和药物缓释材料。PHA单体的立体特异性以及羟基、羧基等活性位点，使其可以作为精细化工合成品的起始原料;一些HA单体还具有特殊的生物学活性和医疗应用前景。PHA合成机制的引进可以提高微生物的适应性，增加抗逆性。近年来又不断开发出PHA作为生物燃料、蛋白纯化系统，药物特异输送系统等多种应用。PHA领域已经形成了一条包含农业、发酵、塑料、包装、生物燃料、精细化工、医药和营养的产业价值链。PHA生产成本的降低、生产和应用的规模化以及开发出更多更成熟的高附加值应用需要微生物学家，遗传学家，植物学家，化学家，高分子科学家，化学工程师，生物技术，医学科学家，政府机构和工业界等跨领域的通力合作。

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Recent Progress in Application of Microbial Polyhydroxyalkanoates

CHEN Guoqiang
(Department of Biological Science and Biotechnology，Tsinghua University，Beijing 100084，China)

Biomanufacturing industry includes biofuels，biomaterials and biochemicals，and it is also called“white biotechnology”.Due to recent policy to promote industries independent of petroleum，CO2reduction and environmentally friendliness，biomanufacturing develops very fast.Being a family of biopolyesters with biodegradability，biocompatibility and chirality;microbial polyhydroxyalkanoates(PHA)has become one of the focuses of biomanufacturing today.Over the past several decades，PHA has been developed into an industrial value chain ranging from industrial fermentation，bioplastics，and biofuels to medical implant materials.In this review，we describe the most recent PHA developments including new applications both in China and aboard.

polyhydroxyalkanoates;biomanufacturing industry;Bioplastics;PHA

R318.08

A

1674－3962(2012)02－0007－09

2011－12－09

陈国强，男，1963年生，教授、博士生导师