钙激活性氯离子通道与高肺血流性肺动脉高压*

陈传斯， 庞玉生

(广西医科大学第一附属医院儿科，广西南宁530021)

高肺血流性肺动脉高压的形成主要是由于长期异常血流动力学改变引起肺动脉内皮损伤、肺动脉中膜平滑肌舒缩功能障碍和肺血管结构重构，进而使血管内径变小，肺血管阻力增加，其中肺动脉平滑肌收缩是重要的成因。

肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)膜上有电压依赖性Na+通道，多种Ca2+、K+和Cl－通道，这些通道的开关将直接或者间接影响血管平滑肌的生理功能。在肺动脉高压的形成过程中，这些离子通道都扮演了很重要的角色，如使膜去极化、钙离子内流和引起血管收缩。

氯离子是细胞内外含量最多的阴离子，它的跨膜转运是一个非常重要的生理过程。已确认氯离子通道与血管平滑肌收缩功能及血管平滑肌细胞增殖密切相关。肺动脉平滑肌细胞膜上氯离子通道主要有钙激活性氯离子(Ca2+－activated Cl－，ClCa)或钙依赖性氯离子(Ca2+－dependent Cl－)通道和容量或肿胀敏感性氯离子(volume－or swelling－sensitive Cl－，Clswell)通道［1］，有研究表明，激活的钙激活性氯离子通道有较强的去极化作用，在调控血管张力和收缩性方面起重要作用［2］。现就钙激活性氯离子通道的生物物理和药理学特点及其对高肺血流性肺动脉高压的影响作一综述。

1 钙激活性氯离子通道的生物物理和药理学特点

钙激活性氯离子通道的激活阈值约为 －45 mV，在肺动脉平滑肌细胞中其分子属于CaCC(calcium－activated chloride channel)，ClCA －2(chloride channel accessory 2);具有时间依赖性、钙依赖性和电压依赖性［3］。我们在膜片钳实验中发现，给予肺动脉平滑肌细胞在－100 mV～100 mV，阶跃电压为10 mV的去极化刺激后，在－50 mV左右时，可引出一瞬间电流(transient current，Itr)，之后出现一时间依赖性电流(time－dependent current，Itd);复极化后产生一长时间内向的尾电流(tail current，Itail)，经证实，Itd和Itail是由氯离子引起的，即钙激活性氯离子电流［Ca2+－activated Cl－currents，ICl(Ca)］，这与国外同类研究结果相一致［2］。ICl(Ca)对钙离子敏感:(1)细胞内钙瞬间释放时，会导致瞬时外向ICl(Ca)的激活;(2)当用含Ca2+的细胞外液灌流时，可引出ICl(Ca);当用无钙含EGTA或含钡细胞灌流液灌流时，ICl(Ca)消失或减少。

目前有2种假设机制用来说明ClCa通道在平滑肌细胞中是如何发挥兴奋功能的［4－5］。第一种假设机制涉及由ClCa通道激动剂引起的血管收缩，与三磷酸肌醇受体(inositol triphosphate receptor，IP3R)通道有关。ClCa通道的激动剂有去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、内皮素 －1(endothelin －1，ET －1)、5－羟色胺(5－hydroxytryptamine，5－HT)、精氨酸加压素(arginine vasopressin，AVP)等［1］。激动剂通过激活膜G蛋白偶联受体Gq，使三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)作用于IP3受体通道，肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)释放 Ca2+，激活 ClCa通道，诱发ICl(Ca);而激活的ClCa通道使膜去极化，足够促使电压依赖性钙通道开放，更多的钙离子内流，引起平滑肌收缩。在这个正反馈循环中，激活的ClCa通道起着重要的作用，而肺动脉平滑肌细胞中钙离子浓度也升高了200～1 000 nmol/L［2］。部分对血管平滑肌细胞ClCa通道的研究表明，它参与了去甲肾上腺素和内皮素等缩血管物质引起的大鼠脑动脉及兔脑动脉等血管收缩，可调节血管张力。Lamb等［6］在大鼠主动脉实验中也证实去甲肾上腺素诱导的收缩与氯离子通道有关。第二种假设机制与肌浆网上ryanodine受体(ryanodine receptor，RyR)通道有关。RyR上存在特异性Ca2+－钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)磷酸化结合位点，CaMKⅡ能增强兔肺动脉［7］和冠状动脉平滑肌细胞［8］上ICl(Ca)强度。咖啡因(caffeine)、ryanodine等通过影响Ca2+内流诱发Ca2+的释放(内流的Ca2+触发细胞内钙池的Ca2+释放)来发挥作用。但不同浓度的ryanodine所起的作用不一样，低浓度 ryanodine(1 nmol/L ～10 μmol/L)使 RyR处于开放状态，高浓度 ryanodine(0.3 mmol/L～2 mmol/L)使RyR关闭［9］。另外，从肌浆网表面 RyR通道产生的自发瞬时钙释放也可引发ICl(Ca)。

ClCa通道的阻滞剂有尼氟灭酸(niflumic acid，NFA)、anthracene－9－carboxylicacid(9－AC)、indaryloxyacetic acid(IAA －94)等［1］。其中，尼氟灭酸是ClCa通道的特异性阻滞剂，它可以减少激动剂诱导的血管收缩效应;浓度在10 μmol/L －100 μmol/L 便可引起细胞膜超极化及血管舒张。但对细胞外高钾介导的收缩效应没有影响［2］。

2 钙激活性氯离子通道在高肺血流性肺动脉高压肺动脉平滑肌细胞中的作用

在平滑肌细胞中，钙激活性氯离子通道的平衡电位(－27 mV)较静息膜电位(－60 mV)更“正”［10］，相对于其它离子来说，ClCa通道易被激活，它的开放将引起去极化的发生，足够强的时候甚至可以使Ca2+通过电压激活的Ca2+通道。

肺动脉高压的病人或动物细胞内钙离子浓度(intracellular calcium concentration，［Ca2+］i)相对于血压正常的病人或动物要高［11］，杨朝等［12］经过实验测出在常氧状态下，PASMCs［Ca2+］i为(123.63 ±18.98)nmol/L，低氧时［Ca2+］i升高，达(281.75 ±16.48)nmol/L。［Ca2+］i的水平是决定 ClCa通道活性的关键因素［13］，它与ClCa通道活性互相影响，其相互作用对PASMCs有一定的调节作用。［Ca2+］i升高可激活ClCa通道，引起膜去极化，开放电压依赖性钙通道，细胞外钙离子内流增加，对［Ca2+］i起正反馈作用，可启动兴奋收缩偶联，最终导致肺血管收缩反应。众多研究也发现，从caffeine敏感型钙库释放Ca2+是低氧性肺血管收缩的早期事件，［Ca2+］i的升高优于低氧诱导的膜去极化作用［14］。

在高肺血流性肺动脉高压模型中，左向右分流所产生的剪切力使肺血管阻力增高、肺动脉压力增高、右心室负荷加重，甚至发生右心功能不全，会使组织出现缺氧。但无论是高肺血流，还是其导致的缺氧均可引起内皮功能紊乱，致血管收缩物质(如5－HT和ET－1等)释放增加。杜军保等［15］的研究表明，在大鼠高肺血流动物模型中，分流11周大鼠血浆ET－1含量及肺组织ET－1mRNA表达明显升高。这些缩血管物质大多可激活ClCa通道，引起氯离子外流，细胞膜去极化，肺动脉平滑肌收缩效应增大。Sun等［16］最近发现，慢性缺氧可以增加ICl(Ca)的电流密度。ICl(Ca)可能介导肺动脉高压中肺血管的过度反应［11］。我们通过腹主动脉－下腔静脉造瘘术制备左向右分流高肺血流性肺动脉高压大鼠模型，发现模型组大鼠PASMCs膜电位(约－37 mV)相对于对照组(约－48 mV)的要明显增高，内向尾电流Itail和电流密度绝对值明显增大，静息膜电位(Em)与Itail和Itail电流密度呈密切相关关系，我们推测，在高肺血流性肺动脉高压形成过程中，内向氯离子电流Itail绝对值的增大，成为复极化后膜电位绝对值降低的一个重要因素，使肺动脉平滑肌细胞易产生收缩反应，对肺动脉压力的增高起了一定的作用。除此之外，莫碧文等［17］在应用氯离子通道阻滞剂三苯氧胺后，发现其可降低缺氧所致大鼠肺动脉压升高、改善右心室肥厚。NFA对低氧人肺动脉［18］、自发性高血压大鼠血管平滑肌［19］的收缩反应有抑制作用。其可能的机制:三苯氧胺或NFA直接抑制钙激活性氯离子通道，使氯离子外流减少，增加细胞内侧的负电荷，钙离子内流减少，血管舒张。这提示我们，钙激活性氯离子通道的开放或关闭在高肺血流性肺动脉高压中起重要作用。

大量临床和实验研究证实，肺动脉平滑肌收缩是左向右分流肺动脉高压的重要成因。在肺血管中，不同细胞群分布的ClCa通道数量不一样，其中以阻力型肺动脉(第3级和第4级分支动脉)平滑肌细胞分布ClCa通道较多［20］。阻力型血管是肺血管张力调节的主要部位，激活的ClCa通道在调控血管张力和收缩性方面起重要作用。另有研究还发现，氯离子通道与血管平滑肌细胞增殖密切相关。李晓慧等［21］在对左向右分流所致肺动脉高压大鼠的肺血管进行分析后发现，肺小动脉中肌型动脉的相对中膜厚度和相对中膜面积明显高于对照组(仅开腹后暴露腹主动脉和下腔静脉，不做动静脉之间的穿刺)。Mercier等［22］在小猪身上也发现，高肺血流使肺动脉平滑肌细胞增殖，主要表现为远端肺动脉内壁增厚。ClCa通道阻滞剂NFA可以通过抑制ClCa通道减慢细胞增殖［12］。因此，对于研究ClCa通道在这些肺小血管中的作用显得更为重要。

3 钙激活性氯离子通道特异性阻滞剂NFA对肺动脉高压的影响

正常人血浆5－HT浓度在1～2 nmol/L，而在肺动脉高压患者中5－HT可上升至30 nmol/L，此浓度足以使离体人肺动脉收缩。Marcos等［23］研究发现，在各种不同类型的严重肺动脉高压病人已有肺动脉重塑的肺动脉中有很强的5HT－1B、5HT－2A、5HT－2B受体免疫染色。还有人发现，5－HT受体和5－羟色胺运载体主要在肺动脉平滑肌细胞内高表达。当5－HT作用于其受体，可引起Ca2+内流，引起血管收缩。另外，在狗、兔等动物实验中发现，若静脉内给予5－HT会增加肺血管的阻力。Yuan等［2］已证实，在大鼠肺动脉平滑肌细胞中，NFA可逆转5－羟色胺所引起的膜去极化，使血管舒张。

NFA是环氧化酶抑制剂，用来抗炎镇痛;同时还是氯离子通道阻滞剂，更被认为是ClCa通道的最强有力的阻断剂［4］。为了验证NFA对ClCa通道的抑制作用，杨朝等［24］通过类似实验来证实。苯福林(phenylephrine，PE)与5－HT一样，具有强的收缩肺循环的作用，可促进Ca2+内流和诱导细胞内钙池Ca2+释放，引起［Ca2+］i升高。NFA可以抑制由PE引起的血管收缩。他们发现在无Ca2+的细胞外液中，用1 μmol/L的PE就可以诱导急性分离所得的PASMCs的［Ca2+］i升高，但使用 NFA 后却没有对［Ca2+］i有影响。由此提示，NFA对肺血管的舒张作用与PE引起的［Ca2+］i的变化无关，而是由于抑制了 ClCa通道。

不仅如此，NFA对ClCa通道的抑制作用是非常强大的。2 μmol/L时对兔门静脉细胞的ICl(Ca)抑制达50%［25］;10 μmol/L就几乎能完全抑制大鼠肺动脉平滑肌上的ICl(Ca)［13］。即使［Ca2+］i浓度达250 ～500 nmol/L，Piper等［26］发现，浓度为 100 μmol/L 的NFA也能抑制其引起的氯离子外流。NFA还能通过抑制ClCa通道，关闭电压依赖性钙通道，使［Ca2+］i降低，减慢细胞增殖，改善肺小动脉增厚;降低门静脉的平滑肌细胞自发收缩的幅度和频率［27］。此外，NFA对心肌细胞也有影响，浓度为100 μmol/L时，能可逆性地抑制INa(voltage－gated Na+current)，影响动作电位的幅度［28］，可能起到抗心律失常的作用。还能够抑制家兔窦房结细胞的If(超极化激活的离子电流)而具有减慢心率的作用。

但Ledoux等［8］发现，NFA可能具有双重效应。2005年，他们在研究中发现，在兔肺动脉平滑肌细胞上，NFA既可以抑制ClCa通道，也可以刺激出现一个持续的呈浓度依赖性的ICl(Ca)。这个持续的ICl(Ca)在［Ca2+］i钳制为500 nmol/L时激发，能被NFA(IC50=159 μmol/L)抑制，在去除NFA后以浓度非依赖性的方式短暂增加2倍。Liantonio等［29］研究结果表明，NFA在大鼠骨骼肌细胞中能促进线粒体钙外流，增加基础的［Ca2+］i。NFA的这些作用是否会影响到它对ClCa通道的抑制，再者，多少浓度的NFA才有可能把这些“副作用”减少到最低呢，还需深入研究。

4 小结

目前，对肺动脉高压的治疗不仅仅是单纯考虑“降压”，更重要的是把阻遏和逆转肺血管重构作为治疗标靶。在动物实验中，一些物质对钾离子、钙离子通道的影响已被证实对预防和(或)逆转肺动脉高压有效。

随着我们对钙激活性氯离子通道功能的深入认识，它的各种特性将逐渐被阐明，有希望筛选出一类高选择性地作用于肺血管、专门治疗高肺血流性肺动脉高压的新型药物;已证实，抑制通过钙激活性氯离子通道向外流的氯离子，对治疗一些疾病及其后遗症是有效果的［30］。作为钙激活性氯离子通道的特异性阻滞剂，NFA也将会越来越受到重视。但我们也应该看到，目前大部分有关钙激活性氯离子通道的研究都是针对低氧性肺动脉高压或其它原因所引起的肺动脉高压，对高肺血流性肺动脉高压的探索还是很少的。NFA在高肺血流性肺动脉高压中发挥调节ClCa通道活性及影响肺动脉张力等作用的具体机制尚待进一步研究。我们课题组将在往后的实验中对此进行深入的研究。

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