分别应用基因芯片和solexa技术研究脐血干细胞体外诱导的巨核细胞基因表达谱

王 芳 何 吉 朱发明 刘晋辉 秦 斐 陈 舒 徐 罡 吕杭军 严力行

人体血液中的血小板在出凝血功能中具有重要的作用，血小板数量降低的病人容易发生大量出血，特别是接受高剂量化疗和造血干细胞移植的病人，体内长时期血小板减少的治疗一直是临床关注的焦点。巨核细胞由造血干细胞分化而成，其产生血小板是一个十分复杂的过程，到目前为止其分子机制仍不明确。本实验采用人脐血干细胞体外TPO诱导扩增分化为巨核细胞，分别应用基因芯片技术和solexa测序技术检测MKs、非MKs的基因和mRNA表达差异，探讨巨核细胞的表达机制、信号传导及调控机制，为造血干细胞分化为巨核细胞用于临床输注打下基础。

材料与方法

1.材料:脐带血由浙江大学附属妇产科医院提供。IMEM培养基、RPMI1640购自美国 Gibco公司;血小板生成素(TPO)、无血清培养基(Stem SpanTMSFEM)购自加拿大Stem Cell公司;鼠抗人CD41a一抗购自捷克Exbio公司;CD34细胞MACS磁珠分选试剂盒购自德国美天尼公司;羊抗鼠IgG免疫磁珠购自美国DYNAL公司;光学显微镜购自Nikon公司;TRIzol Reagent购自美国 Invitrogen公司，RNA纯化(QIAamp RNA Blood Mini Kit)购自德国QIAGEN公司;RNA抽提试剂盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit)购自德国Qiagen公司;RTPCR试剂盒(SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis System)购自美国Invitrogen公司;引物自行设计，由上海申能博彩公司合成;基因芯片制作及软件分析由上海生物芯片有限公司提供;solexa测序及软件分析由杭州华大基因研发中心提供。

2.方法:(1)HSCs的体外分离、纯化、扩增培养和诱导分化:脐带血标本与生理盐水以1∶1充分混匀，加到比重为1.077g/ml的淋巴细胞分离液上，收集中间的单个核细胞层，MACS磁珠分选 CD34+造血干细胞。……