应用酵母双杂交系统筛选E2F1相互作用蛋白*

廉 超， 王晓通， 谢玉波， 肖 强△

(广西医科大学第一附属医院 1胃肠腺体外科，2麻醉科，广西南宁530021)

在我国，胃癌的发病率及死亡率位居所有恶性肿瘤首位。而胃癌的发生发展是一个多步骤、多基因参与的复杂过程。E2F1转录因子(E2F1 transcription factor)作为重要的细胞周期相关转录因子，与肿瘤发生发展及细胞凋亡调控密切相关［1］。我们前期研究显示，E2F1在人胃癌组织中呈高表达，在癌旁和正常组织中均呈低表达［2］，这提示E2F1的表达与胃癌的发生发展密切相关。本研究应用酵母双杂交系统，以E2F1为诱饵蛋白，从人正常胃黏膜细胞的cDNA文库中筛选出E2F1相互作用蛋白，为进一步研究E2F1影响胃癌发生发展的分子机制奠定了基础。

材料和方法

1 材料

酵母表达载体pGBKT7、酵母表达载体pGADT7、人正常胃黏膜细胞 cDNA 文库［3］和 pGBKT7－E2F1诱饵质粒［4］均由本实验室保存;酵母菌AH109、SD酵母基础培养基和－Trp－Leu－Ade－His营养缺陷培养基、－Trp－Leu营养缺陷培养基、YPAD培养基和X－Gal均购自Clontech;测序公司为北京蛋白质组研究中心(BPRC)。

2 方法

2.1 酵母感受态制备及文库转化效率测定 按照Clontech公司说明书(Matchmaker system Yeast Protocols Handbook)方法制备AH109感受态细胞，将pGBKT7－E2F1 pGADT7和文库质粒共转化酵母菌AH109，最终得到酵母菌种悬浊液10 mL，取10 μL 稀释 107倍，再取 100 μL 涂布于 SD/－Trp－Leu的培养基营养缺陷型平板，30℃培养3～5 d，经观察，共生长出18个单克隆，并据此计算文库转化效率。

2.2 酵母双杂交筛选阳性克隆 将共转化后的AH109首先划线于SD/－Trp/－Leu/－Ade/－His培养基平板，30℃培养3～5 d，待长出克隆后，挑取，依次划线于SD/－Trp/－Leu培养基平板，使其充分地生长复苏。并同时划线阳性对照(以pGBKT7－53和pGADT7－T质粒共转染的AH109)和阴性……