诺卡菌属菌株04-5195发酵产物5195B的分离鉴定及其体外抗骨质疏松活性研究

孙银玲，贺晓波，李永臻，孙海峰

诺卡菌属菌株04-5195发酵产物5195B的分离鉴定及其体外抗骨质疏松活性研究

孙银玲*，贺晓波*，李永臻，孙海峰

近年来研究证实，增强成骨细胞作用、改善骨质形成代谢、促进骨质形成是治疗骨质疏松新的更为重要的途径。成骨细胞的增殖和分化受多种因素调节，其中骨形态形成蛋白家族尤其是骨形态形成蛋白 II（BMP2）在成骨细胞分化过程中起着关键作用，其作为骨形成诱导因子有望成为骨质疏松治疗的新靶点。

本课题组在前期工作中，成功构建了以bmp2启动子为靶点、含有萤火虫荧光素酶报告基因的稳定转染细胞模型。将在荧光素酶报告基因上游克隆有bmp2基因上游调控序列的重组质粒 pGL4-bmp2转染至小鼠颅骨细胞MC3T3-E1，经 G418 筛选得到单克隆稳定转染细胞株bmp2-Luc MC3T3，利用已知的活性化合物验证和优化该bmp2上调剂筛选模型，证明其良好的特异性、灵敏度和稳定性均符合高通量筛选模型的要求。应用该模型对微生物产物馏分库进行筛选，得到能产生高活性物质的菌株04-5195。通过对 04-5195 的形态特征鉴别、生理生化指标判别、DNA 序列比对及系统发育分析结果证明其为诺卡菌属的新种菌株[1]。对 04-5195 菌株发酵产物通过正相层析分离得到了化合物 5195A，经鉴定为 Amicoumacin B[2]，但其并非主要活性组分。本工作采用新的分离工艺流程对菌株发酵产物重新分离，得到 5195B，经鉴定为大豆素（daidzein），体外研究证明其具有上调 BMP2 表达和促成骨细胞分化的作用。

*同为第一作者

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株 诺卡菌属新种菌株 04-5195 由中国医学科学院医药生物技术研究所菌种保藏中心提供。

1.1.2 细胞株 人骨肉瘤细胞株 MG63 购自中国医学科学院细胞中心；SV40 大 T 抗原转染人成骨细胞 hFOB1.19购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）。

1.1.3 试剂盒 荧光素酶检测试剂盒购自美国 Promega公司；Real-time PCR 试剂盒购自瑞士 Roche 公司；碱性磷酸酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.1.4 主要实验仪器 Agilent 1200 LC 型高效液相色谱仪购自美国 Agilent 公司；AKTAexplorer 快速蛋白液相色谱（FPLC）购自美国 GE Health 公司；Envision 荧光读板仪购自美国 PE 公司；Rotor Gene 3000 型实时定量 PCR仪购自澳大利亚 Corbett Research 公司；Epics XL 型流式细胞仪购自美国 Beckman Coulter 公司；UV-2401 型紫外分光光度计购自日本 Shimadzu 公司；LTQ Orbitrap 型质谱分析仪购自美国 Thermo 公司； VNS 600 型核磁共振分析仪购自美国 Verian 公司。

1.2 方法

1.2.1 5195B 的分离纯化 04-5195 发酵产物经抽滤，将滤液和菌丝体分离。滤液过 HP20 大孔树脂柱后，分别用3 倍柱体积的水、30% 和 50% 丙酮洗脱，收集 50% 丙酮洗脱液，减压旋转蒸发除去丙酮，真空干燥得到干品 A。04-5195 发酵菌丝体使用 50% 丙酮充分浸泡，抽滤，除去溶剂后得到干品 B。干品 A 使用 30% 甲醇重新溶解，过ODS 反相柱，在 FPLC 上分别用 3 倍柱体积的 30% 和50% 甲醇洗脱，紫外 248 nm 检测，对 50% 甲醇洗脱组分按峰收集，收集液旋转蒸发去除甲醇并真空冻干后，使用反相制备 HPLC 进一步纯化（色谱柱：Agilent 9.4 mm ×250 mm；流动相：50% 乙醇；流速：2 ml/min；保留时间：9.4 min），得到活性单体化合物 5195B。干品 B 按与干品 A相同条件分离得到活性单体化合物 5195C，经鉴定与5195B 结构相同。

1.2.2 5195B 的结构鉴定 对 5195B 进行了紫外光谱分析、质谱分析、核磁共振氢谱、碳谱分析（DEPT、HSQC、COSY、HMQC），通过文献查阅进行比对以确定化合物结构。

1.2.3 BMP2 表达上调活性研究

1.2.3.1 利用 BMP2 表达上调剂模型评价药物活性 消化对数生长期的模型细胞bmp2-Luc MC3T3，按每孔 5 ×104个接种至白壁透明底 96 孔板中。待细胞充分贴壁后，吸弃含血清培养基，用 PBS 轻轻漂洗细胞 1 次，每孔加入不含血清 MEM 培养基 198 μl 和 2 μl 待测样品，以终浓度 1 μg/ml 的染料木素为阳性对照，以与待测样品相同浓度的 DMSO 为空白对照。作用 24 h 后移去培养基，使用荧光读板仪测定荧光素酶活性。按如下公式计算待测样品对荧光素酶活性的相对上调率：相对上调率（%）＝（S －B）/（P － B）× 100%（S 为待测样品组细胞荧光素酶活性；B 为空白对照组细胞荧光素酶活性；P 为阳性对照组细胞荧光素酶活性）。

1.2.3.2 Real-time PCR 法考察药物对 MG63 细胞bmp2mRNA 水平的影响 以不同浓度 5195B（1、5 和 10 μmol/L）处理 MG63 细胞 24 h，TRIzol 法提取细胞总RNA。引物设计：上游：5′ CGGACTGCGGTCTCCTAA 3′；下游：5′ GGAAGCAGCAACGCTAGAAG 3′。采用 2-ΔΔCT方法进行数据分析。

1.2.3.3 流式细胞法考察药物对 MG63 细胞 BMP2 蛋白表达的影响 以不同浓度 5195B（1、5 和 10 μmol/L）处理 MG63 细胞 24 h，4% 多聚甲醛固定细胞，一抗为山羊抗人 BMP2 单抗，二抗为 FITC 标记兔抗山羊 IgG，每个样本计数 5000 ～ 10 000 个细胞。

1.2.4 体外试验考察药物促成骨细胞分化作用

1.2.4.1 碱性磷酸酶（ALP）活性检测 以不同浓度 5195B（5、10、20 和 50 μmol/L）处理 hFOB 细胞（SV40 大 T抗原转染人成骨细胞）72 h，收集细胞培养液，以 ALP 检测试剂盒测定细胞分泌的 ALP 活性，以样本在 520 nm 处的吸光度判断 ALP 活性高低。

1.2.4.2 钙化结节形成检测 以不同浓度 5195B（5、10、20 和 50 μmol/L）处理 hFOB 细胞，培养 4 周后，von Kossa 染色显示钙化结节，每个样本随机选取 10 个视野。

2 结果

2.1 5195B 的结构鉴定

5195B 为白色粉末，易溶于甲醇、乙醇、DMSO 等溶剂。UV λmaxMeOH为 248、302 nm。ESI-MS 给出 [M+1]+为255，则其分子量为 254。5195B 核磁共振分析数据如表 1所示，经查询，与大豆素一致，证明 5195B 为大豆素，结构如图 1 所示。

2.2 5195B 在 BMP2 表达上调剂模型上的量效关系

5195B 从 40 μmol/L 向下倍比稀释，以染料木素为阳

注：于 600 MHz 测定氢谱；150 MHz 测定碳谱。

图 2 5195B 在 BMP2 表达上调剂模型上的量效关系

表 1 5195B 的氢谱和碳谱数据性对照，通过检测荧光素酶活性，得到药物在 BMP2 表达上调剂模型上的量效关系曲线（图 2），表明其在 0.1 ～10 μmol/L 浓度范围内以剂量依赖方式增加模型细胞表达荧光素酶，EC50= 1.911 μmol/L。

2.3 5195B 对 MG63 细胞 BMP2 表达水平的影响

实时定量 PCR 和流式细胞实验分别从 mRNA 和蛋白水平验证了 5195B 上调 BMP2 表达的作用。在设定剂量下，5195B 处理 MG63 细胞的 BMP2 mRNA 和蛋白水平明显升高，药物上调活性与剂量呈正相关，在 10 μmol/L浓度下可分别上调 2.56 倍和 2.28 倍（图 3、图 4）。

2.4 5195B 对成骨细胞的促分化作用

碱性磷酸酶（ALP）活性增强及细胞外基质钙化是成骨细胞分化的两个重要标志。ALP活性检测结果显示，5195B在一定剂量下能上调细胞分泌的 ALP 水平。20 μmol/L 浓度条件下有最大的上调活性（P＜ 0.01），而继续升高药物浓度则对 ALP 活性提高没有帮助（图 5）。钙化结节形成实验则更直接地证明了 5195B 的体外促成骨细胞分化作用，在 10 μmol/L 和 20 μmol/L 浓度下，与空白对照组相比，钙化结节形成数目均有显著性升高（表 2）。

图 3 5195B 对 bmp2 mRNA 表达的影响

图 4 5195B 对 BMP2 蛋白表达的影响

图 5 5195B 对细胞分泌 ALP 活性的影响

表 2 5195B 对成骨细胞钙化结节形成的影响

3 讨论

从诺卡菌属新种菌株 04-5195 发酵产物中提取得到5195B，经鉴定与大豆素结构相同。研究发现，大豆素在以bmp2启动子为靶点的 BMP2 上调剂筛选模型上有确切的活性，在 MG63 细胞上的试验验证了大豆素上调 BMP2表达的作用。进一步在 hFOB 细胞上的研究证明，大豆素有体外促成骨细胞分化作用，这与文献报道 BMP2 在骨形成中的关键促进角色相一致。已知 BMP2 主要从两方面促进骨形成：一是直接促进成骨细胞分化[3]。BMP2 在骨的再生和修复过程中能促进成骨细胞分化并抑制其凋亡[4]。BMP2 可募集并诱导骨髓干细胞分化为成骨细胞及软骨细胞以及通过环磷酸腺苷（cAMP）诱导间充质细胞不可逆地分化为骨细胞并重塑幼骨。二是 BMP2 能增加成骨细胞标志基因OPN，Cbfa1，Col I alpha1，BSP，ALP，fabp4等的表达[5-6]，这些基因的相应蛋白在成骨细胞分化中起非常关键的作用。大豆素能上调 BMP2 表达，这可能是其促成骨细胞分化作用的分子机制之一。但成骨细胞分化受多因素综合影响，BMP2 相关信号通路尚未完全清楚。大豆素促骨形成作用更详尽的机制、及其上调 BMP2 表达的直接作用位点尚有待更深入的研究。

大豆素是一种植物雌激素，具有异黄酮类结构。该类结构化合物常具有预防心血管疾病、清除氧自由基、抗癌、舒缓妇女更年期症状、预防骨质疏松等保健作用[7-8]，其中，染料木素、依普黄酮、红曲米提取物被明确报道有促进BMP2 生物活性的作用[9]，依普黄酮已在临床上被用于改善骨质疏松引起的骨量减少方面的治疗。植物雌激素防治骨质疏松的经典机制是其选择性作用于雌激素受体，在骨组织表现出雌激素样作用，最终通过减少破骨细胞生成或抑制破骨细胞活性来抑制骨吸收, 防止骨量过多丢失。本工作证明大豆素上调 BMP2 表达并能在体外促进成骨细胞分化，这为从不同角度理解该类化合物改善骨质代谢的作用机制提供了证据。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.015

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150040 哈尔滨，黑龙江中医药大学药学院（孙银铃、孙海峰）；100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所重点室（贺晓波、李永臻）

孙海峰，Email：shf120@sina.com

2012-03-16

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