H+-ATPase弱化菌株的筛选及其应激性研究

霍贵成，崔 兰，刘 飞,3

（1.乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；3.丹尼斯克（中国）有限公司，江苏 昆山 215300）

随着酸奶品种与营养价值的不断增加，酸奶保质期短的问题亟待解决[1]。酸奶是含益生菌的乳制品，正常发酵结束后，在产品贮存、运输、销售、食用前这一过程中发生后酸化现象时会出现过酸味及感官质量下降，影响酸奶保质期[2]。德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）具有很强的产酸能力和耐酸性，当外界pH降低时，胞内pH也在降低，德氏乳杆菌保加利亚亚种细胞质膜中的质子泵（H+－ATPase）能够通过将胞内质子泵出胞外来提高胞内的pH，形成跨膜的pH梯度差，从而使代谢酶的活力不受影响，使其在低pH下仍然能够生长。因此，可以通过改变H+－ATPase的活性来控制酸奶的后酸化。本文利用新霉素来筛选H+－ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种自发突变菌株，并对其酸应激和冷应激特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种：德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1.9201来源于乳品工业微生物菌种保藏中心（DICC）。培养基：MRS培养基和12%（W/V）脱脂乳培养基。试剂：新霉素（购自Amresco公司）；BCA蛋白质浓度测定试剂盒（购自碧云天公司）；其他化学试剂均为分析纯。

主要仪器：紫外分光光度计DU－800（Beckman公司）；680型酶标仪（美国伯乐）；DHP－9272型电热恒温培养箱（上海－恒科技）；飞鸽离心机GL－20G－Ⅱ。

1.2 方法

1.2.1 H+－ATPase缺陷突变菌株的筛选

将菌株KLDS1.9201用MRS培养基活化2次，第3代在37℃下培养至对数期，取0.1 mL菌液涂布于含有300 μg·mL－1新霉素的MRS平板上，37 ℃培养72～96 h，选取单菌落接种于液体MRS培养基，37℃培养24 h，然后涂布于含有新霉素（300 μg·mL－1）的MRS平板上。……